精品资源共享 安徽省共享课程 合肥工业大学研究生精品课程
电子教案

高级微生物

讲义

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

食品与生物工程学院

 

 

 


目录

 

第一章 绪论 ....................................1

第二章 微生物的多样性及其基因资源 ..............18

第三章 重要的工业微生物 ........................27

第四章 微生物遗传 ..............................29

第五章 微生物药物产生菌的菌种选育 ..............49

第六章 DNA重组及基因工程构建 ...................59

第七章 微生物发酵与发酵工程 ....................60

第八章 微生物在生物技术中的重要作用 ............74

第九章 微生物活性物质的结构与功能 ..............84

第十章 微生物学研究进展及其应用 ................86

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


第一章  绪论

一、 微生物与人类关系

微生物给人类能带来利益吗?

微生物给人类也带来危害吗?

微生物给人类带来的利益不仅是享受,而且涉及到人类的生存。

微生物是人类的朋友

1.1 对生命科学的贡献

生命科学由整体或细胞研究水平进入分子水平,取决于许多重大理论问题的突破,其中微生物起了重要甚至关键的作用,特别是对分子遗传学和分子生物学的影响最大。

长期争论而不能得到解决的“遗传物质的基础是什么?”的重大理论问题,是在以微生物为材料进行研究所获得的结果才无可辩驳地证实:核酸是遗传信息的携带者,是遗传物质的基础, 从而促进了许多重大理论问题的突破。

60年代Nirenberg等人通过研究大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系及多聚尿苷酶,发现了苯丙氨酸的遗传密码,继而完成了全部密码的破译,为人类从分子水平上研究生命现象开辟了新的途径。

70年代,由于在微生物中的许多重大发现,包括质粒载体,限制性内切酶,连接酶,反转录酶等,才导致了DNA重组技术和遗传工程的出现,使整个生命科学翻开了新的一页。

1.2 微生物被广泛应用在工业、农业、医药等领域。

例如:面包、奶酪、啤酒、抗生素、疫苗、维生素、酶等重要产品的生产,微生物在其中起到了其他生物不可替代的作用;同时微生物也是人类生存环境中必不可少的成员,有了它们才使得地球上的物质进行循环,否则地球上的所有生命将无法繁衍下去。

据保守估计,自从抗生素被广泛应用于传染病治疗以来,全球的人均寿命至少延长了15岁!

二、 微生物是人类的敌人

微生物是一把十分锋利的双刃剑,这把双刃剑的另一面--微生物的“残忍”性给人类带来的灾难有时甚至是毁灭性的。

举例:

天花:公元165年,一场可怕的流行性天花席卷了整个罗马帝国。仅在罗马每天都有2000人死亡,它整整肆虐了15年。 

鼠疫:即黑死病,在公元3~6世纪,它席卷了整个罗马帝国。

公元1346~1361年,爆发了一场著名的黑死病潮,在这场病中,总共有2400万人死亡,相当于整个欧洲大陆人口的1/3

一些历史学家认为这场灾难甚至改变了欧洲文化。

流行性感冒: 400多年前,意大利威尼斯城的一次流感大流行使六万人死亡,惊慌的人们认为这是上帝的惩罚,所以将这种病命名“魔鬼”

1957年和1968年发生的两次全球性流感,病人总数达10亿多 

流感病毒,属粘病毒科基因组为负链单链RNA基因组分成8个片段,分别编码不同的蛋白

斑疹伤寒: 18126月,这种由虱子传染的疾病曾经毁掉了拿破仑的大部分军队。

拿破仑率领近50万大军入侵俄国,当大军行至波兰和俄国西部的时候,近半数士兵因斑疹伤寒和痢疾而死亡或丧失行动能力。至18136月撤出莫斯科行动结束时,拿破仑手下只有3000多名士兵。 

1985年发现首例艾滋病病人,截止2001年底,全国累计报告艾滋病病毒感染者30736人,其中艾滋病病人1594例,死亡684例。专家估计,实际艾滋病病毒感染者已超过85万人,现存活艾滋病病人约8~10万。

主要分布:

云南(10 525例)新疆(6 030例)广西(3 740例)

广东(2 704例)  河南(1 677例)四川(1 139例)

北京(911例)  安徽(538例)   上海(529例)

微生物引起肿瘤: 约有16%的肿瘤是由病毒感染引起的

已经确认的引起肿瘤的病毒有:

Epstein Barr 病毒:引起鼻咽癌,伯杰氏淋巴瘤等

乙肝病毒:肝癌

丙肝病毒:肝癌

人乳头瘤病毒(1618型):子宫颈癌

T细胞白血病病毒:白血病

 

微生物疾病的现实威胁:

原来的病原微生物并没有消失

鼠疫:在我国许多地区依然时有发生

结核病:在得到有效控制后,近年再度猖獗

病毒性肝炎:仍然是我国危害最广的疾病之一

疟疾:热带地区的多发病……

新的病原微生物不断产生……

全球死亡率最高的疾病

. 几位微生物学家

微生物学奠基人——巴斯德

路易·巴斯德(18221895)法国化学家、微生物学家,近代微生物学的奠基人。出生在法国东部的多尔。 

1862年,当选为法国科学院院士。

1867—1888年间,任巴黎高等师范学校物理化学实验室主任,提出发酵理论,研制成功羊炭疽病、鸡霍乱、猪霍乱、狂犬病疫苗。

现代细菌学之父——科赫

罗伯特·科赫(1843—1910),德国生物学家。大学毕业后,踏上乡村医生的道路。在自己的诊所里,科赫发明了细菌分离法、细菌染色法。

此后,科赫又发现了霍乱弧菌、疟原虫、锥体虫等病原菌,发现了治疗牛瘟、淋巴腺鼠疫、回归热、昏睡病等传染病的方法。1905年,被授予诺贝尔生理学及医学奖。

汤飞凡,中国第一代医学病毒学家

1897723日生于湖南醴陵县。1958930日卒于北京。1914年考入湘雅医学院,1921年毕业并获得美国康涅狄克大学医学博士学位。

1955年首次分离出沙眼衣原体,无可争辩地结束了半个多世纪关于沙眼病原的争论。 

田波院士

田波,男,19311225日生于山东桓台县, 分子病毒学与生物工程研究室主任,中国科学院微生物所研究员、中科院院士、著名病毒学与生物工程专家 

魏江春院士

男,汉族,陕西省咸阳市秦都区人,1931111日生,中共党员。俄罗斯生物科学博士、中国科学院微生物研究所研究员、中国科学院院士。地衣真菌学家,主要从事地衣生物多样性及其系统演化生物学研究,尤其对世界范围石耳科 (Umbilicariaceae)地衣进行了系统而深入的研究。 

郑儒永院士

郑儒永,中国科学院院士,真菌学家。一直致力于真菌分类系统的合理化与完善。在国际上首次发现了高等植物中的内生毛霉,并首次报道了我国特有的人体病原毛霉新种和新变种。

庄文颖院士

庄文颖,女,汉族 1948727日出生于北京。研究员、实验室主任,菌物学专业。1988年毕业于美国康乃尔大学,获博士学位。主要从事菌物物种多样性与分子系统学研究。真菌学家。现任国际菌物协会执委会委员中国菌物学会常务副理事长、“生物多样性”副主编、国际刊物MYCOTAXONFUNGAL DIVERSITY的编委等职。

 

微生物对人类有利也有害,但人类的生存与生活离不开微生物!

 

四、 现代工业微生物学的兴起及其发展

大型发酵罐搅拌装置

人类社会经济发展的危机

 

工业微生物及其应用

4.1 工业微生物

工业微生物是指应用于发酵工业的微生物。发酵一词来源于拉丁语沸腾的派生词,用于描述酵母作用于果或麦芽浸出液时的现象。其实,这种沸腾现象是由果汁或麦芽浸出液中的糖在缺氧条件下被降解而产生二氧化碳引起的。

只有具备了这些条件的菌株,才能保证发酵产品的产量和质量,这既是发酵工业的最低要求,也是发酵工业的最大目的。

4.2 工业微生物的应用

氨基酸发酵:氨基酸发酵起始于1958年,其中谷氨酸是生产最早、产量最大的氨基酸。

氨基酸发酵所用的微生物主要是短杆菌和棒杆菌属的一些种,如黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌、谷氨酸棒杆菌等。

抗生素发酵:20世纪40年代青霉素应用于临床以来,抗生素为人类的健康做出了卓越的贡献。

1928年英国科学家Fleming发现了在含金黄色葡萄球菌的平板上污染了青霉菌后,在青霉菌周围细菌不能生长的现象。他把这个青霉菌分离出来后再进行培养,发现其培养液能抑制各种细菌生长,并经动物试验证实其没有毒性,他依照青霉菌(Penicillum)的名字将其中的活性成分命名为青霉素(Penicillin) 

青霉素在临床上的奇异疗效,激发了世界各国有关学者的研究热情。

1944waksman发现了由链霉菌产生的链霉素用于治疗由细菌特别是结核杆菌引起的感染有特效。这个发现使人们对从土壤中寻找由放线菌产生的抗生素充满了信心。此后陆续发现了氯霉素、金霉素、土霉索、制霉菌素、红霉素、丝裂霉素C等,由此造就了抗生素发展的黄金时代。

微生物酶制剂发酵:酶是一种具有催化活性的蛋白质。20世纪40年代末,生产a一淀粉酶的深层液体发酵首先在日本实现了工业化生产,标志着现代酶制剂工业的开始。

酶制剂根据其来源可以分为动物、植物及微生物酶;依据其用途可分为工业用、分析用及药用。目前已有100多种酶能够大规模工业化生产,其中大部分是通过微生物发酵生产的。 

酶制剂的用途非常广泛,尤其是作为临床医疗、诊断和   分析用的酶制剂,是一个富有前景的领域,如链激酶(血栓、提高创伤和烧伤疗效)、己糖激酶(分析葡萄糖,诊断血糖及糖尿病)、乳酸脱氢酶(分析血清谷丙转氨酶,诊断病毒性肝炎、黄疸、急性心肌梗死)等。

有机溶剂和有机酸发酵:溶剂和有机酸都是微生物的初级代谢产物,与工业生产和人们的日常生活有着密切的关系,也是工业发酵中历史最悠久、吨位最大、价格最低的产品。

微生物生产的溶剂及其他化工产品包括酒精、丙酮、丁醇、丁二醇等。重要的微生物有梭菌,它能产生各种各样的有机溶剂,如丙酮、丁醇、异丙醇、丁酸等,常用的梭菌有丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、糖乙酸丁醇梭菌。

有机酸在食品加工、医药、化工等领域的许多方面都有广泛的应用。发酵法生产有机酸涉及的微生物主要是细菌、霉菌等。有机酸中生产最早、产量最大的是柠檬酸。

核酸类发酵许多核苷酸类物质如5IMP5GMP等具有强化食品风味的功能,因此利用微生物发酵生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。核苷、核苷酸及其衍生物的另一重要应用领域是用于临床治疗药物,如嘌呤类似物8氮鸟嘌呤和6巯基嘌呤具有与抗生素类似的功能,可以用于抑制癌细胞的生长。

目前工业上主要通过酶法水解RNA来生产核苷酸。RNA的来源很广,如啤酒厂的废酵母、单细胞蛋白及其他发酵工业的废菌体,其中以酵母中提取RNA为最常见。 

微生物多糖发酵: 微生物多糖在化工、医药方面的应用具有广泛的前途,如由甘蓝黑腐病黄单胞菌产生的黄原胶可用于石油工业和消防,也可作为增加食品黏度的添加剂;由大型真菌产生的多糖类物质则是传统的滋补性药物,具有抗癌功能。

微生物生理活性物质的发酵: 随着生命科学各领域的迅速发展,从微生物的代谢产物中寻找具有生理活性的物质(如酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等) 近几年的研究热点之一。这类物质是在抗生素研究的基础上发展起来的。

为了区别于一般抗 生素并强调其在医疗上应用的可能性,Monaghan等将这类物质称为生物药物素(biopharmacetin) 

维生素类生理活性物质发酵: 这类产品包括维生素AB2B12CD,以及一些维生素的前体,如维生素C的前体山梨醇,维生素A的前体β胡萝卜素以及维生素D的前体麦甾固醇等。

激素类药品、单细胞蛋白单细胞蛋白(SCP)是以烃类、酒精或工农业废物为原料,通过大规模培养酵母或细菌,取出细胞,经干燥和灭菌后可以作为人类食物或动物饲料。

环境净化微生物在环境保护中扮演着十分重要的角色,微生物法已经成为污水、废气和固体废弃物处理的主要方法。

4.3 微生物冶金

利用微生物进行石油脱硫、探矿、冶金是近年来研究和开发的一项新技术,特别是细菌冶金,适用于贫矿、尾矿和稀有矿的处理。

4.4食品发酵  

食品发酵是工业微生物最古老的内容,主要包括酿酒发酵和调味品发酵。

酒类饮料主要利用酵母菌发酵制作。酒类大致可以分发酵酒(啤酒、葡萄酒、绍兴滔)、蒸馏酒(白酒)和配制酒(药酒)。调味食品主要有酱油、豆酱、食醋、乳制品。酱油和豆酱是用酱油曲霉酿制的;食醋是用醋杆菌进行有氧发酵生产的;乳制品是用乳酸菌或和酵母混合发酵制备的。

5. 微生物遗传与育种

遗传学是生命科学领域中一门核心学科,主要研究遗传物质的结构与功能以及遗传信息的传递与表达。

经典遗传学主要研究遗传物质纵向传递的规律以及基因型与表型的关系。 

分子遗传学侧重研究基因的结构、功能和横向传递。结构是指遗传物质的化学本质与精细结构,功能是指遗传物质的复制、表达、调控、重组与变异。

群体遗传学研究群体中基因频率和基因型频率以及影响其平衡的各种因素。

与生命科学其他学科相比,遗传学具有以下特点:

①遗传学是一门推理性的学科。遗传学的研究方法是根据自然现象或实验数据推理出一种假设,然后通过实验加以验证。

②多学科交叉与融合。遗传学主要建立在生物化学、细胞生物学和统计学的基础上,但又涉及生命科学的各个领域。

③发展快。遗传学的发展非常快,新理论、新技术、新成果层出不穷。       

④应用性强,转化为生产力的周期短。以遗传学为理论基础,已派生出许多应用学科,如动植物及微生物育种学、优生学、生物工程学等。

5.1 遗传学的形成与发展
1 、孟德尔以前及同时代的一些遗传学说

公元前5世纪希波克拉底(Hippocrates)提出了第一个遗传学理论,他认为子代之所以具有亲代的特征是因为在精液或胚胎里集中了来自身体各部分的微小代表元素。

1809年拉马克(JBLarmarck)提出了用进废退的进化论观点并由此得出获得性状、(acquired characteristics)是可以遗传的。这是拉马克一生中最大的错误。

1866年达尔文(Darwin)提出了泛生论(hypothesis of pangensis)认为身体各部分存在一种胚芽或泛子(pangens)它决定所在细胞的分化和发育。

1883年威廉(WRoux)提出有丝分裂和减数分裂的存在可能是由于染色体组成了遗传物质,他还假定了遗传单位沿着染色体作直线排列。

1883年和1885年魏斯曼(Weismann)提出了种质论认为许多细胞可分为种质和体质两部分,种质是独立的、连续的,能产生后代的种质和体质。 

1869年高尔顿(FGalton)用数理统计方法研究人类智力的遗传。发表了天才遗传,认为变异是连续的,亲代的遗传性在子女中各占一半,并彻底混合,即融合遗传论。由于他所选择的研究性状是数量性状,所以虽然他的结论是正确的,但只适合于数量性状,不能作为遗传的普遍规律。

5.2 遗传学的诞生

在孟德尔以前就已经有一些植物学家做了植物杂交实验,并取得了显著的成绩。

1797年奈特(TKnight)将灰色和白色的豌豆进行杂交,结果杂交一代全部是灰色,而杂交第二代产生灰色和白色。

1863年诺丹发表了植物杂交的论文,他认为:①植物杂交的正交和反交的结果是相同的;②在杂种植物的生殖细胞形成时负责遗传性状的要素互相分开,进入不同的性细胞中,否则就无法解释杂种二代所得到的结果。

1866年奥地利遗传学家孟德尔(GJMendel)根据8年植物杂交实验,发表了植物杂交实验的论文(即现在的孟德尔分离定律和自由组合定律),但他的工作当时并未引起重视。直到1900年,狄夫瑞斯(HDevries)、科伦斯(CFJCorrens)和切尔迈克(EVTschermak)三位植物学家分别同时发现了这篇论文和它的价值,才使孟德尔学说重见天日,并建立了遗传学这门学科,这就所谓孟德尔定律的重新发现。

1901年狄夫瑞斯提出了“突变”这一名词。

1902SuttonBoveri首先提出了染色体是遗传物质的载体的假设。

19021909年贝特森先后刨用了遗传学(genetics)、等位基因(allele)、纯合体(homozygotls)、杂合体(hererozygotls)、上位基因(epistatic gene)等名词。

1909年约翰逊(Johannsen)创用了基因(gene)、基因型(genotype)和表型(phenotype)等名词。此时遗传学的雏形已形成,遗传学作为一门新的学科终于诞生了。

5.2 遗传学的发展

遗传学的发展大致可分为三个时期。

第一个时期是细胞遗传学时期(19101940)。此时期主要是确立了遗传的染色体学说。

1910年摩尔根(Morgan)和他的学生们用果蝇做材料研究性状的遗传方式,提出了连锁交换定律,并确定基因直线排列在染色体上。这样,就形成了一套经典遗传学的理论体系。经典遗传学的基本单位是一个不可再分而且是抽象的基因。

第二个时期是微生物遗传学和生化遗传学时期(19411969)。这一时期的特点是遗传学研究的对象从真核生物转向原核生物,并更深入地研究基因的精细结构和生化功能。

重大成果有一个基因一个酶的建立(BeadleTatum1941),遗传物质为DNA的确定(Avery1944)、跳跃基因的发现(RMe(1intock1951)DNA双螺旋结构模型的建立(WatsonCrick1953)、中心法则的提出(Crick1958)

此期间遗传的基本单位是顺反子(cistrons),它是具有一定功能的实体,在不同的位点上可以发生突变和重组。

第三个时期是分子遗传学时期,从1953年双螺旋结构模型的建立到现在。

此期间的主要贡献有乳糖操纵子模型的建立(JacobMonod1961),遗传密码的破译(NirengergKhirana1964),逆转录酶(Temin1975)DNA合成酶(Kornberg1958),限制性内切酶的发现(Arber1962年,1968年;Smith1978)DNA体外重组技术的建立(Berg1972)DNA测序(SangerGilbert1977),转座子的移动(Sharpino1980)核酶的发现(CechAltman1981)

PCR技术的建立(Swithies1986),内含子的发现(SharpRoberts1977),体细胞克隆羊的成功(wilmut1997)以及人类基因组计划的完成(199010月启动,20006月完成框架图,20022月完成精细图)

现在基因的概念是一段可以转录为功能性RNADNA,它可以重复、断裂的形式存在,并可转座。

  一是通过从不同生态环境中取样进行菌株分离和筛选,从广阔的自然界中获得新的菌种。分离微生物新种的具体过程大体上可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。

  二是对已有菌种进行遗传诱变,从中筛选获得具有优良性状的菌株。

传统的微生物遗传育种工作方法包括以下几种。

1、常规育种/自然选育

2、诱变育种

根据育种需要,有目的地使用诱变因素,可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状。目前用于微生物诱变育种的因素有紫外线、激光、X射线、Y射线、快中子等物理因素和烷化剂、天然碱基类似物、亚硝酸和氯化理等化学因素。在物理诱变因素中,紫外线比较有效、实用、安全,其他几种射线都具有用高性质,具有穿透力,使用时有一定的危险性。化学诱变剂的突变率通常要比电高辐射高,并且经济实用,但这类物质多为致癌剂,使用的必须谨慎。目前,许多诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定,人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂,以达到预期的育种效果。

3、杂交育种 

杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本,所以不论是方向性还是自觉性,均比诱要有种前进了一大步。

另外,杂交育种往往可以消除某一菌株在诱要处理后所出现的产量上升缓慢的现象,因而是一种重要的育种手段。但杂交育种方法较复杂,许多工业微生物有性世代不十分清楚,因而不像诱变育种技术那样得到普遍推广和使用。直到1978年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体融合技术后,杂交育种技术才获得了飞速的发展。在渗透压稳定剂存在下,利用溶菌酶或溶壁酶将微生物细胞壁溶解,可制备得到原生质体。原生质体同时融合可以被化学诱融剂如聚乙二醇(PEG)所诱导。而电融合技术在细菌中报道比用PEG诱导的融合频率要高得多。

4、基因工程育种 

广义的基因工程为代谢工程

代谢工程作为各学科间的交叉研究领域,利用现代遗传学工具对代谢途径进行修饰以促进细胞的性状也日益显现出卓越的成效。

代谢工程着眼于对原核生物和真核生物系统初级代谢途径的修饰,发展新的工具并引入对微生物和其他生物的遗传控制,对改变了的细胞生理进行评估。利用了数学

方法以推导代谢途径的结构,以及在代谢途径中的动力学分配。利用NMR做磁共振)波谱和气相色谱质谱法探测示踪化合物富集和进行同位素质量测定,利用代谢物和同位素平衡的方法在体内确定细胞内代潮流的走向和分布。

该领域的进一步发展得益于基因组学、蛋白质组学和其他新的技术,如探查细胞表达表型的DNA微阵列技术的发展。

狭义的分子育种”(molecular breedng指有效地对亲本性质进行重组而在子代群体中产生极大的多样性。是对现存的多样性进行有效重组以设计具有多项功能参数的生物系统的有力的工具。

微生物分子育种是指运用微生物分子遗传学原理,利用基因工程、细胞工程和代谢工程等现代化技术对某种具有特定生产目的的微生物菌株有目的地改造,消除不良性状,增加有益的新性状,以提高产品的产量和质量的一种新的有种方法。

5.3 微生物分子育种

(一)发展史和主要研究领域

20世纪70年代以来,快速发展的基因工程操作,直接提供了在基因水平上改造微生物菌株性状的方法。

近二十年采,基因工程育种技术在许多方面都有突破性的进展,从获得目的基因的方法、不同生物种类的基因表达系统、筛选重组子的方法等了一系列行之有效的克隆、表达方法,建立了多种表达和分泌的系统。

20世纪70年代以来,快速发展的基因工程操作,直接提供了在基因水平上改造微生物菌株性状的方法。

各种杂交技术、PCR(聚合酶链反应技术、基因芯片和蛋白质芯片技术、各种分析技术、高通量筛选技术、生物信息学等多样新技术、新方法、新理念的提出、应用与发展,加速了微生物分子育种的步伐。 

许多优良的工业微生物菌种被选育出来,并被用于国内外的工业、农业和环境保护等领域。

应用微生物分子育种技术所获得的菌株大多用于多种酶、维生素、氨基酸、激素、抗生素以及其他一些次生代谢物质的生产。

改良后的微生物用于环境保护降解多种非天然化学物质,用于植物保护、杀灭植物病害等方面取得了令人瞩目的进展。

生物制药工业

  1975年生产了第一个单克隆抗体.   

  1977年人类基因在细菌中得到表达,鼠胰岛素基因被克隆。

  1979,杂合的酵母,大肠杆菌穿梭载体对酵母原生质体的转化成功。

  1984年,Chiron克隆了人免疫缺陷病毒(HIV 基因组并进行了序列测定。

 1986年,α干扰素和第一个重组B型肝炎疫苗被批准生产,1987年组织血纤维蛋白溶酶原激活因子被批准生产。

人类基因组计划始于1988年,在这一年批准了第一个转基因动物专利。

 1991年,粒细胞克隆刺激因子(GCSF)被批准。

 1992年批准因子。一年后,β-干扰素获得批准。

重组DNA技术被应用于初级代谢研究领域。

 重组大肠杆菌产生的丙酮产率可达9g/L,比丙酮丁醇羧菌还要多。

大肠杆菌还被改造为优秀的乙醇生产菌株(LOIngram1987),产乙醇达43%(体积分数

采自运动发酵单胞菌(Zsmomonas mobilis)编码醇脱氨酶 和丙酮酸脱羧酶的基因转入大肠杆菌;成为NAD再生的主要系统。

DNA芯片的应用

DNA芯片作为微型化高通量的平行分析设备,有利于检测微生物在特定生理状态(如对高产率有利的状态)下特征性基因的差别表达,结合PCR扩增技术,通过标记探针和分子杂交反应,可以进行定量的基因表达分析。

高通量筛选(High throughput screeningHTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,以计算机分析处理实验数据,在同一时间检测数以千万的样品,并以得到的相应数据库支持运转的技术体系,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。

简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息,并从中找到有价值的信息。 

对生物制药所作的努力主要还是在选择对重组DNA适宜的宿主菌方面。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在工业发酵中具有长期的历史,该菌可以分泌外源蛋白到培养基中,以及可以产生单细胞细菌所不能产生的糖基化蛋白质,因而也是生产外源蛋白常用的宿主菌。另外,其核细胞可以进行转录后修饰。

在很多实验应用中,采用了更高等的真核生物如昆虫细胞培养物生产重组蛋白。

在一些发生错误糖基化(例如有的用酵母菌和昆虫细胞培养物时)的例子中,采用了哺乳动物细胞来生产蛋白质。

重组DNA技术用于生产工业用酶是件很自然的事情,因为通常这些酶都是由单个基因产生的。

随机突变可以使酶的性质产生多样性变化,定位诱变日经成为改良酶性质的一种常用技术。

酶的定向进化技术

  该技术采用了多样化的方法随机性产生大量突变酶,包括通过DNA改组(DNA shuffling)、易错PCR或增变菌株产生酶的突变体,然后通过强有力的选择或筛选技术从突变文库中筛选得到最好的突变体。DNA改组通过把来源于不同生物的相似基因汇集在一起,用限制性内切酶酶切、重组,形成数百个新的个体。该方法模仿了自然界的突变、选择和重组过程以获得高度适应性的蛋白质,但比自然界的过程要快得多。最有兴趣且意义重大的是对人和其他生物基因组的测序。

 微生物基因组学研究的重点已由结构基因组学转向功能基因组学。微生物功能基因组学不仅要阐明微生物基因组内每个基因的功能,还要研究基因的调节及表达谱,进而从整个基因组及全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解微生物生命活动的全貌,揭示微生物世界的规律,并使之为人类社会服务。

与真核生物相比,虽然微生物的基因组相对简单,但仍具有重大的科学和经济意义。

可以预测,基因组序列将导致许多新的药物的发现,将来的制药工业不仅提供药物,而且提供基因、细胞和组织器官。

希望这种努力可以预防和/或治疗一些复杂的疾病,例如阿尔茨海默型老年痴呆症、帕金森病、癌症。艾滋病和很多遗传性紊乱病。

5.4 微生物分子育种展望

近二十年来,随着分子遗传学和分子生物学各顶新技术的快速发展,微生物分子育种领域已经得到长足的进展,人类可以逐步按照自己的设计对微生物进行改造,使其更好地为人类造福。

1、微生物育种新方法新技术的发展

目前,各种分子生物学、生物化学和生物物理学的新技术、新方法不断发展与涌现,包括基因芯片技术、微阵列技术、荧光定量实时检测技术、蛋白质双向电泳技术、各种图像检测和分析平台技术、多维液相色谱技术、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术、表面等离子共振技术等多种大规模、高通量检测、分析技术与仪器的问世和逐步推广,对微生物分子生物学和微生物分子育种起到了极大的直接或间接的推动作用。

微阵列技术

一种研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。这种方法利用机械手精确地将大量DNA分别点到载玻片上。研究者然后从他们研究的细胞中提取的DNA标上荧光标记。标记探针能与载玻片上的DNA互补连接。将载玻片放入扫描仪下,测量每个荧光点的亮度,亮度反映了特定DNA片段存在的量。 

基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是蛋白质组应用研究的最佳仪器,高质量的MSMS/MS (PSD)数据通过数据库的自动搜索就可以得出极可靠的结果。无法比拟的灵敏度可以对双向电泳中最弱点进行准确分析。

应用领域:主要对多肽、蛋白质、核苷酸、糖蛋白、多糖及高聚物进行检测和鉴定。 

Time of Flight Mass Spectrometer (TOF) 是一种很常用的质谱仪。这种质谱仪的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管,并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大,到达接收器所用时间越长,离子质量越小,到达接收器所用时间越短,根据这一原理,可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大,扫描速度快,仪器结构简单。这种飞行时间质谱仪的主要缺点是分辨率低。 

表面等离子共振仪  

仪器特点
表面等离子共振(SPR, Surface Plasmon Resonance)是用于表征表面折射系数改变的光学专业技术所说的表面一般是固相和液体间的界面。

SPR应用领域包括:薄膜、自组装单分子层的形成及性质,蛋白质、核苷、医药品、表面活性剂等分子间的交互作用。 

基于表面等离子体共振技术((Surface plasmon resonanceSPR),又称表面等离子体子共振,表面等离激元共振,是一种物理光学现象)的表面等离子体共振仪是已经成为物理学、化学和生物学研究的重要工具。

当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面(比如玻璃表面的金或银镀层)时,可引起金属自由电子的共振,使一部分光能量在金属表面发生迁移,从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中,使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化,得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 

进一步发展有效技术,利用分子遗传学和分子生物学技术建立并完善各种宿主菌的遗传转化及分泌、表达系统;

通过开展基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢网络的研究,从全局的水平上了解基因表达调控的规律

采用高通量筛选技术进行基因组定位进化、代谢途径工程、蛋白质工程等对蛋白质和菌株进行有目的改造,已经成为微生物分子育种领域的发展趋势。

代谢工程;又称途径工程(path-way engineering)。是基因工程的一个重要分支。细胞的代谢网络至少是由上千种酶、膜传递系统、信号传递系统所组成的,同时它又受到精密调控且互相协调的复杂系统,因此代谢工程一般是多基因的基因工程。

通过基因工程的手段来改变分叉代谢途径的流向或阻断有害代谢产物的合成等原理,来改变微生物代谢的流向,增加某些产物的产量,也可通过引入外源基因来延伸原来的代谢途径,产生新的末端代谢产物,或者利用新底物作为生物合成的原料,也可以通过构建新的代谢途径合成具有新化学结构的代谢产物。
2、加强对微生物菌株资源和基因资源的开发和利

近年来,国内外对极端微生物和极端酶的研究进展很快。日本、美国和欧洲的一些国家纷纷投资开展海洋极端微生物和极端酶的研究,从海洋极端微生物获得了嗜冷α一淀粉酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、

嗜热淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖甘酶、木聚糖酶、DNA 聚合酶、耐盐蛋白酶、谷氨酰胺酶、耐有机溶剂的菌株,利用海洋蓝细菌Anabaena Species TU371在氮气和氮气环境中光合作用产氢、从海洋链霉菌中分离到抗赤腐病原菌 Pythium PorPhyrae  引起紫菜属赤腐病的抗真菌蛋白等。

最令人振奋的是美国的文特尔等人在马尾藻海的细菌中发现了121万余种基因,超过以前公共数据库所列微生物种基因的总数,全新基因达7万余种。其中,有782个基因蛋白质产物对光敏感,还发现约5000个新基因的功能涉及氢能的开发。整个进展情况都显示了开发海洋微生物基因资源的重要性和紧迫性。

马尾藻海 

马尾藻海又称萨加索(葡语葡萄果的意思)海,是大西洋中一个没有岸的海 ,又称“洋中之海”。

马尾藻海上大量漂浮的植物马尾藻属于褐藻门马尾藻科,是最大型的藻类,是唯一能在开阔水域上自主生长的藻类。 
3、采用分子方法发现难培养微生物

批量 DNA克隆法(bulk DNA cloning),即提取环境样品的总DNA,用限制酶消化后克隆到入载体上。用这种方法所建立的基因组文库在回收不同分类成员的rRNA时排除了选择倾向。但在实践中,这种方法的主要缺点是DNA文库的多数成员不会有rRNA基因。

进一步发展的快速而有效的方法是采用 16S rRNA基因专一性引物,通过PCR介导进行 16SrRNA基因或基因片段的扩增(可以利用环境样品中的rRNArDNA),然后克隆到大肠杆菌中,分离个别的基因拷贝。采用这种程序所建立的 16S rRNA基因的群体库可以进一步通过样品克隆、限制酶消化、观察对专一性探针的反应或者进行全部或部分序列测定等方法采进行序列比较。

4、高通量筛选和基因芯片技术 

高通量筛选high throughput screeningHTS)体系适于进行高通量筛选的基因表达体系有多种,其中酵母细胞是主要的表达体系。

用于HTS的吸测方法多以酶联免疫吸附分析(ELISA)方法为基础,目的在于确定配基和受体的相互作用。常采用荧光或酶标比色法代替同位素标记法进行检测。

以基因表达产物为靶位建立的药物筛选模型与传统模型相比,具有以下优点:

靶位专一、特异性强;

通过基因克隆扩增可以获得足够量的靶位物质;

与采用动物及其组织提取物的方法比较,费用明显降低;

所建立的模型适于HTS全自动快速大量筛选的新体系。

近年来微生物基因组学的发展,为高通量寻找药物靶位提供了新的研究思路,即首先应用生物信息学技术寻找微生物的保守基因,再用基因灭活技术从保守基因中寻找微生物生长的必需基因,并以此作为候选药物靶位。最后,应用综合方法对这些靶位进行筛选,寻找新微生物药物的候选分子或化合物。

用重组DNA技术导入定向改造的基因,以改进微生物细胞的某些代谢特性,已经发展成为工业微生物育种和发酵过程优化的强有力的工具。

基因的修饰与表达是代谢工程的重要组成部分。基因组学和各类分析技术的发展促进了代谢工程领域的迅猛发展。

基因组的顺序可以提供对个别基因和整个途径的转录控制有重要作用的基因和基因内部控制元件的信息。

利用微型化高通量的DNA芯片技术可以鉴别特定生理状态下差别表达的基因。结合PCR技术,通过标记探针和分子杂交反应可以对基因表达进行定量分析。

DNA芯片技术可用于基因突变的检测、基因多态性分析和基因图谱的绘制等,用途十分广泛。

表达谱芯片技术可以检测微生物不同菌株之间或同一株菌在不同的生理条件下基因的差异表达情况,如营养条件、离子强度、极端pH值的细胞应答、细胞密度依赖的基因表达、低氧和高氧的基因调节和休眠诱导、病原体和宿主的相互作用、不同遗传背景菌株基因的表达差异等。可以说DNA芯片技术具有十分巨大的应用潜力。

5 生物信息技术

生物信息学是采用计算机技术和信息论方法研究生命科学中各种生物信息的表达、采集、储存、传递、境索、分析和解读的科学,是现代生命科学与信息科学、计算机科学、数学、物理学、化学等学科交叉渗透形成的新兴前沿学科。生物信息学具有把基因组序列数据翻译成知识的潜力。

生物信息学技术直接指导对新基因和新的结构功能域的发现、对代谢途径工程的设计、对突变酶的设计与改造等,在多方面发挥了重要的作用。可以预见,生物信展学技术在微生物分子育种领域具有越来越广泛的应用。 

CGustafsson等人(2003)指出,在蛋白质工程领域也存在复杂的多变量问题。在其他工程领域发展起来的数学和数据挖掘工具现在已经被应用于进行催化剂设计、分析肽和蛋白质的序列与活性的关系,帮助设计具有特定性质的新肽和新蛋白质等。

在开展蛋白质工程时,采用生物信息学方法可以指导对生物催化剂的定点突变进行理性设计。在生物信息学技术的指导下,已经对枯草杆菌蛋白酶、二氢叶酸还原酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等许多种类的蛋白质进行了定点突变改造。

在我国,微生物分子育种的研究和应用无论在工业、农业或环境保护诸方面都已经获得引人瞩目的进展。

例如在微生物农药方面,除了杀虫与防病细菌制剂以外,对杀虫病毒、真菌和农用抗生素等方面都开展了研究,尤其在与社会经济发展关系重大的环境与特殊微生物的研究方向国家已给予重视。

研究内容除农业环境污染以外,还涉及工业、城市、水域等重要污染物降解的微生物技术,对近年来成为国际研究热点的难培养和极端环境微生物资源的开发利用也加强了研究的投入,并已取得了多项重要的研究和应用成果,显示出微生物生物技术的巨大潜力和广阔的应用前景。

第二章 微生物的多样性及其基因资源

微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源。其生物多样性在维持生物圈和为人类提供广泛而大量的未开发资源方面起着主要的作用。
    微生物的多样性包括微生物的生活环境、物种、形态、结构、生理代谢类型、微生物与生物环境间的相互关系、遗传等方面的多样性。

1.1 微生物的多样性

人类利用微生物加工食品具有古老的历史,近代应用微生物生产有用产物已建立多种生物技术产业。

为了持续开发微生物产物,造福社会,人们必须寻找更多类型的微生物,通过研究,获得新的产物。显然,寻找新的微生物成为持续发展微生物技术的首要工作。

因此,对微生物在自然界存在的场所,所谓生境(habitat)须有所认识(1-1)

微生物种类繁多,包括细菌、真菌、病毒、单细胞藻类和原生动物。

在生物圈中,微生物分布范围最为广泛,一般生物不能生存的极端环境,如高温泉、大洋底层、高酸、高碱、高盐水域都有极端微生物生活。

微生物在生物圈的物质循环中起着关键作用,对人类生活和社会发展也起着其他生物不能替代的作用。

   微生物生活环境:

地球上,除了火山中心区域外,从土壤圈、水圈、大气圈直至岩石圈,到处都有微生物的踪迹。甚至在极其恶劣的环境中也可找到微生物,如万米高空中,万米海底,数百米岩石中均有微生物生存

1.2 多样性的广度

从表1-2数字可以看出,人们对低等生物种类知之甚少,对细菌、古细菌和病毒总数的估计很有问题,因为从环境中分离和培养它们是困难的,特别是对于专性寄生性种类。

为什么会出现这一种情况?主要是人们在实验室所设计的培养基和培养条件还不能重复生境中的条件,还不适合各种微生物生长的需要。

但是,已有多方面的论据,指明生境中微生物是极为丰富的。

微生物的物种:目前发现的微生物物种共有10万种,随着分离、培养方法的改进和研究工作的深入,微生物的新物种、新属、新科甚至新目、新纲屡见不鲜。

1.3 原核生物是未曾观察到的多数

美国Georgia大学微生学系、生态学系和深海科学系几位专家对地球上原核生物作了估算,他们的结论是:原核生物是未曾看到的多数(the unseen majority)

人类对微生物物种多样性的了解最为贫乏: 以原核生物界为例,除少数可以引起人类、家畜和农作物疾病的物种外,对其它物种知之甚少。已知种占估计种的比例从下面的两张统计表中可以看出。

中国微生物已知物种数与世界已知物种数的比较

微生物的已知种数和估计总种数

1.4 绝大多数微生物还不能培养

美国微生物学家Colwell的实验室在1982年提出不能培养的微生物的概念。

Colwell编辑专著Nonculturable Microorgani- sms in the Environment (1999),总述各个领域里不能培养的微生物的研究结果。到目前人们共同的认识是生境中存在的微生物中不能培养的占绝对多数 

1.5 微生物资源的保护和开发 

微生物受威胁状况:

  一些野生食用和药用菌,由于过度采收造成资源日益枯竭。

  例如冬虫夏草(Cordyceps sinensis),仅分布中国青藏高原高海拔地区,50年代前后年产在20000kg以上,由于严重滥采,产量逐年下降,真品少,掺杂不少霍克斯虫草(Cordyceps hawkesii)或其他虫草。

微生物资源的开发:

微生物资源的开发,是21世纪生命科学生命力之所在。由于动植物物种消失是可以估计的,这就意味着微生物多样性的消失现象也在发生,如何利用和保护微生物多样性已成为亟待解决的问题。 

近年来,世界各国和国际组织已对此做了许多努力,并提出了一项微生物多样性行动计划 

微生物多样性行动计划:

建立推动微生物多样性研究的国际组织; 

召开关于微生物的概念和分类指征研讨会; 

提出已知种的目录; 

发展微生物分离、培养和保藏的技术; 

发展微生物群落取样的标准; 

提出选择自然保护区和其它需要长期保护的生态系等。

1.6 中国微生物多样性的保护 

中国已建立的数百处自然保护区同时也为真菌提供了就地保护的良好场所。 

发展林业是木生食用菌、药用菌、菌根菌和地下块菌资源可持续利用的根本保证,与此同时要实行计划采收,以达到保护资源,林菌并举,获得最佳经济效益的目的。

菌种保藏是迁地保护的一种方法。中国科学院微生物研究所菌种保藏室共保藏菌种1万余株。目前中国菌种保藏工作跟实际需要还有很大距离,应该结合物种多样性调查对各种野生菌进行分离、培养和保藏。 

已知菌种来源和菌种保藏中心

1.7 微生物多样性图例

Bacillus anthracis 
炭疽杆菌

Esherichia coli 
大肠杆菌

Enterococcus faecium
屎肠球菌

Staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌

肺炎链球菌
Streptococcus pneumoniae

Vibrio cholerae
霍乱弧菌 

破伤风梭菌
Clostridium tetani

细菌荚膜

梅毒螺旋体
Treponema pallidum 

Streptomyces lividans 1326
浅青紫链霉菌 

Streptomyces lavenduale NRRL 2564
淡紫灰链霉菌 

支原体

立克次氏体——细胞内寄生

立克次氏体——线粒体的祖先

衣原体Chlamydis

粘细菌myxobacteria

蛭弧菌

酵母菌yeast

青霉

黑曲霉的分生孢子头

曲霉引起脑和皮肤感染

曲霉感染脑部

仙女圈

地衣

蘑菇 Agaricus campestris

木耳 Auricularia auricula

冬虫夏草 Cordyceps sinensis

红毛盘菌 Scutellinia scutellata

松乳菇 Lactarius deliciosus

松口蘑  Tricholoma matsutake

白黄蜜环菌 Armillaria albolanripes

黄绿蜜环菌 Armillaria luteo-uirens

粪鬼伞 Coprinus sterqulinus

灵芝 Ganoderma lucidum

烟草花叶病毒的电镜及模式图

乙肝病毒电镜及模型

病毒的个体形态

二十面体病毒

变型的二十面体衣壳

 

 

2. 微生物基因组与基因资源

基因组的概念

基因组(genome)这个名词最早于1922年出现在遗传学的文献中,指的是单倍体细胞中所含的整套染色体。所以genome这个名词又被译为染色体组。近年来,学术界更多的把genome定义为整套染色体中所包含的全部基因。基因组这个名词逐渐代替了染色体组。

基因组(genome)是指存在于细胞或病毒中的所有基因。基因组通常是指全部一套基因。

由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能,因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的 DNA 序列组成的总称,包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的 DNA 序列。

但无论是原核还是真核微生物,其基因组一般都比较小(表 8 - 1 ) ,其中最小的大肠杆菌噬菌体 MSZ 只有 3000bp,含 3 个基因。

生物基因组的特点

1.原核微生物基因组的特点

1)结构简单,原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的,只有非常小的一部分不转录,这与真核DNA的冗余现象不同。

2)存在转录单元,原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因,往往丛集在基因组的一个或几个特定部位,形成功能单位或转录单位。

3)有重叠基因,长期以来,人们认为基因是一段DNA序列,这段序列负责编码一个蛋白质或一条多肽。但是,已经发现在一些细菌和动物病毒中有重叠基因,即同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息。

2.真核微生物基因组的特点

在真核细胞中,染色体的形状较小,不同生物的染色体数差别很大

微生物操纵子的存在使微生物生长因子现象变得容易解释,例如在微生物发酵青霉素的工业实践中,往往在发酵液中添加玉米浆,研究发现,玉米浆中有苯甲酸和苯甲胺类物质充当中间体。这类物质可以认为是青霉素发酵中的效应物。

一般来说,这些依赖于宿主生活的病毒基因组都很小。

近年来对微生物基因组序列的测定表明,能进行独立生活的最小基因组是一种生殖道支原体,只含 473 个基因,通过与流感嗜血菌序列比较研究,提出了 256 个基因可能是维持细胞生命活动所必需的最低数量的假说。

(一)大肠杆菌的基因组

大肠杆菌基因组为双链环状的 DNA 分子,在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中,该小体称为拟核( nucliod ) ,其上结合有类组蛋白蛋白质和少量 RNA 分子。

基因组全序列测定于 1997 年由 Wisconsin 大学的 Blattner等人完成,其基因组结构特点如下:

1.遗传信息的连续性

大肠杆菌和其他原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数(通常以 1 000 bp -1 500 bp 为一个基因计),说明这些微生物基因组 DNA 绝大部分用来编码蛋白质、 RNA ;用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。 

2.功能相关的结构基因组成操纵子结构

大肠杆菌基因组测序推测出 2192 个操纵子。其中 73 %只含一个基因, 16 . 6 %含有 2 个基因, 4 . 6 %含有 3 个基因, 6 %含有 4 个或 4 个以上的基因。 

3.结构基因的单拷贝及 rRNA 基因的多拷贝

在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的,但是编码 rRNA 的基因往往是多拷贝的,大肠杆菌有 7  rRNA 操纵子,其特征都与基因组的复制方向有关,即按复制方向表达。 

4.基因组的重复序列少而短

原核生物基因组存在一定数量的重复序列,但比真核生物少得多,而且重复的序列比较短,一般为 4 - 40 个碱基,重复的程度有的是十多次,有的可达上千次。

(二)詹氏甲烷球菌的基因组

詹氏甲烷球菌Methanococcusjannnnaschii 属于古生菌该菌发现于 1982 年。生活在 2600m, 2.63Xl07Pa ( 260 个大气压, 94 ℃ 的海底火山口附近。 

1996 年由美国基因组研究所 The lnstitute for Genomiic Research 简称 TIGR 和其他 5 个单位共 40 人联合完成了该菌的基因组全测序工作。这是完成的第一个古生菌和自养型生物的基因组序列。根据对该菌全基因组序列分析结果完全证实了 1977 年由 Woese 等人提出的三界学说。因此有人称之为“里程碑”的研究成果。

从目前已知的詹氏甲烷球菌和其他古生菌的基因组全序列分析结果来看,几乎有一半的基因通过同源搜索在现有的基因数据库中找不到同源序列。例如詹氏甲烷球菌只有 40 %左右的基因与其他二界生物有同源性,其中有的类似于真细菌,有的则类似于真核生物,有的就是二者融合。

可以说古生菌是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。

原核微生物的基因调控:原核微生物的基因调控系统有很多种,但对微生物生产实践有指导意义的主要是操纵子学说。

操纵子学说是由法国巴斯德研究所著名科学家JacobMonod1961年首先提出,并在十多年间经过许多科学家的补充和修正得到逐步完善。

操纵子的主要结构组成:

原核生物的基因调控系统是由一个操纵子 和它的调节基因所组成。每个操纵子又包括三种功能上紧密相关的基因结构基因,操纵基因,和启动基因。

操纵子的主要分类:

1 负控诱导系统,阻遏蛋白不与效应物(诱导物)结合时,结构基因不转录。

2 正控诱导系统,效应物分子(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态

3 负控阻遏系统,阻遏蛋白与效应物结合时,结构基因不转录。

4 正控阻遏系统,效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。

乳糖操纵子的诱导机制

代表 以乳糖的负调节(negative  control)为例

抑制调节:在缺乏乳糖诱导时,其调节蛋白--阻遏物一直结合在乳糖操纵基因上,抑制结构基因的转录

诱导调节:即调节蛋白与结合而变构,阻遏物丧失与乳糖操纵基因的亲合力,操纵子打开,转录与转译进行

关闭基因:当诱导物耗尽,阻遏物又关闭基因

乳糖操纵子的正调节(positivecotrol)

结合启动:即当调节蛋白(CRP:  cAMP受体蛋白)降解物激活蛋白(CAP)直接与启动基因结合则是正调节起始之时

转录与转译RNA多聚酶结合到DNA上转录启始位点,则转录与转译顺利进行。 

强化诱导 CRPcAMP相互作用,则能提高CRP与启 动基因的亲和力而强化诱导。

(三)啤酒酵母的基因组

啤酒酵母是单细胞真核生物,1997年,由欧洲、美国、加拿大和日本共 96 个实验室的

633 位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作,这是第一个完成测序的真核生物基因组。该基因组大小为 13.5 X 106bp ,分布在 16 个不连续的染色体中(表8 - 2)。 

(四)土壤和水样中DNA及多样性研究

土壤和海水浮游微生物提取DNA已有成熟方法。

土样DNA可采用回收细胞和裂解,或者直接裂解,而用碱性缓冲剂抽取。所得DNA须再经纯化。如加入PVP(pvplyvinylpyrrotidone聚乙烯吡咯烷酮)去除腐殖酸物质,是必要的步骤。从l00 g土样可获得l mg经纯化的DNA,足够进行多样性比较研究。

(五)土壤微生物 DNA 的文库构建

1998  Wisconsin 大学的学者与一家制药公司开始了土壤 DNA 文库构建。他们从波士顿附近的土样抽取 DNA ,再将大片段 DNA ( 100-300kb )插人 BAC 载体,再转化到 E . coli ,获得重组文库(图 1- 5 ) ,并对土壤微生物群体的基因组命名为偏基因组 ( metagenome )。

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome

将土样中不能培养微生物 DNA 的大片段( DNA > 50kb )连接于 BAC ,重组载体转化 E . coli

上述学者从所构建的偏基因组文库中找出一百多个 16SrRNA 基因,显示序列的广阔多样性,其中有的与已知细菌群相近,但大部分的序列代表了未经鉴定的细菌。

 70 个序列组成系统进化树,如图 1- 6 所示。图中注有种名的序列均从构建的偏基因组中找出。

 

3. 生物多样性保护与人类生存的关系

生物多样性是指各种生命形式的资源,它包括数百万种的植物、动物、微生物、各个物种所拥有的基因和由各种生物与环境相互作用所形成的生态系统以及它们的生态过程,是物种多样性、遗传多样性、生态多样性、景观多样性的总和,是所有生命系统的主要特征之一。

生物多样性保护就是要保护地球上一切生物资源及人类的生存环境。我们的衣、食、住、行及物质文化生活在许多方面都与生物多样性有着密切的关系,:食物、纤维、木材、药材和多种工业原料等,特别是食物是无法用化学合成产品取代的。

今世界上正面临着人口、资源、环境、粮食与能源五大危机,这些危机的解决都与地球上生物多样性有着密切的关系,但是目前生物多样性正以惊人的速度丧失。 

生物多样性保护与可持续发展:

各种各样的生物资源为人类生存、发展提供了物质墓础,保护生物多样性是建设可持续发展社会的需要. 由于人类活动的加剧,引起全球环境的迅速恶化,可持续发展正面临生物多样性急剧减少的危机. 当前应通过宣传和教育,加强法制建设,控制人口,依靠科技进步等来保护生物多样性,以实现可持续发展.

生物多样性(Biologlcal DiversityBiodiversity)是指生物所有来源的活的生物体中的变异性这些来源除其它外包括陆地、海洋和其它水生生态系统及其所构成的生态综合体这包括物种内、物种之间和生态系统的多样性。

生物多样性是自然界赋予的巨大财富,这笔自然财富对维持人类的生存与发展有着无可替代的重要意义. 然而,由于人类活动的加剧,引起了全球环境的迅速恶化,致使地球上的生物多样性不断减少,大量物种趋于灭绝,人类生存的基础正在逐渐瓦解.保护生物多样性已成为当前全世界关注的热点.

生物多样性的功能:

生物多样性包括遗传、物种、生态系统与景观多样性。从以下几个方面综述了生物多样性的功能:稳定生态系统的作用;提高生态系统生产力的作用;生物多样性对生态系统可持续性的作用;生物多样性在农业生产上的作用;生物多样性在医学上的作用;生物多样性在工业上的作用。

生物多样性与生态系统功能:最新的进展与动向生物多样性与生态系统功能的关系及其内在机制是当前生态学领域的重大科学问题。2002年以来人们不再过多地纠缠于“抽样-互补之争,对这一世纪课题的认识又有了新的进展。

(1)人们开始运用已有的知识揭示更大时间和空间尺度上的物种多样性-生态系统功能关系;

(2)非生物因素与多样性-生产力的交互关系吸引了许多实验研究。人们发现:物种多样性-生产力关系可能会受到资源供给率和环境扰动的修正,环境因素可能是多样性-生产力关系的幕后操纵者;

(3)人们开始重视营养级相互作用对于多样性-生态系统功能关系的影响;

(4)人们开始认真思考物种共存机制在多样性-生态系统功能关系的形成中所扮演的角色。

理论模型研究表明,不同的物种共存机制会导致不同的多样性-生产力关系。

 

 

 

 

 

第三章 重要的工业微生物

工业上重要细菌及其应用 

Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害,但也有些大肠杆菌是致病的,会引起腹泻和尿路感染。  

O-157(肠胃出血性大肠杆菌)本身对人无害,获得新基因产生溶血菌素破坏人体的红血球、血小板和肾脏组织。

有鞭毛的大肠杆菌的菌体在医学上称O抗原”,根据其性质不同,可将所有大肠杆菌分为173类,O-157即指编号为157的大肠杆菌O抗原。

大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速,而且营养要求低。

应用:

大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖

大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌

工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等

大肠杆菌也是食品业和饮用水卫生检验的指示菌根霉(Rhizopus)

代表种米根霉R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。

应用:①根霉能产生一些酶类,如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等,是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。②有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。③有的也可用于甾体转化

分布:广泛分布于土壤、空气中,也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上,引起霉腐变质。

形态特征:菌丝发达、繁密;白色无隔多核,为单细胞真菌。

形态特征:毛霉的孢子囊梗有单生的,也有分枝的。分枝有单轴、假轴两种类型。

毛霉的菌丝多为白色,孢子囊黑色或褐色,孢子囊孢子大部分无色或浅兰色,因种而异。

繁殖:可形成孢囊孢子、厚垣孢子、接合孢子。

分类:多数属于子囊菌亚门,少数属于半知菌亚门。

分布:广泛分布于土壤、空气和谷物上,可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质,有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。

形态特征: 菌丝发达多分枝,有隔多核,分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞——foot cell足细胞)上垂直生出;分生孢子头状如菊花。曲霉的菌丝、孢子常呈现各种颜色,黑、棕、绿、黄、橙、褐等,菌种不同,颜色各异。

繁殖:无性繁殖产分生孢子;大多数有性阶段不明,归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子,归为子囊菌亚门。---大多数为无性世代产分生孢子;少数种可形成子囊孢子。

代表种:黑曲霉(Asp . Niger、黄曲霉(Asp.flavus)

应用是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。②是生产酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、果胶酶)的菌种。③生产有机酸(如柠檬酸、葡萄糖酸等)④农业上用作生产糖化饲料的菌种。

分类:多数属于子囊菌亚门,少数属于半知菌亚门。

分布:广泛分布于土壤、空气、粮食和水果上,可引起病害或霉腐变质

形态特征:与曲霉类似,菌丝也是由有隔多核的多细胞构成。但青霉无足细胞,分生孢子梗从基内菌丝或气生菌丝上生出,有横隔,顶端生有扫帚状的分生孢子头。分生孢子多呈蓝绿色。扫帚枝有单轮、双轮和多轮,对称或不对称。

繁殖:无性繁殖产分生孢子;大多数有性阶段不明,归为半知菌类。少数种可形成子囊孢子,归为子囊菌亚门。

代表种:产黄青霉(Pen.chrysogenum)

桔青霉Pen.citrinum)

展青霉(Pen.patulum)

应用:是生产抗生素的重要菌种,如产黄青霉和点青霉都能生产青霉素。

生产有机酸,如葡萄糖酸、柠檬酸

危害:霉变、疾病 

 

 

 

 

 

 

 

 

第四章  微生物遗传

4.1. 基因结构和基因组

一、基因结构和基因概念的发展

1.基因结构

从分子遗传学的角度上讲,基因是一段具有特定功能和结构的连续的DNA片段,是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。一个完整的基因,不仅包括编码区,还包括5末端和3末端长度不等的特异性序列,它们虽然不编码氨基酸,却在基因的转录过程中起着重要的调节作用(图129)。

1 原核基因的结构 

所有原核基因都有一个编码区,依基因类型的不同,或是编码一种蛋白质多肽或是编码一种RNA结构,如 tRNA rRNA。在原核基因编码区两侧,还存在着用于控制转录作用的调节区,即启动子和终止子。在DNA链上,由起始密码子开始到终止密码子为止的一个连续编码序列,叫做开放阅读框架(open reading frameORF),也就是所谓的编码区。

启动子(promoter)是位于基因5末端上游外侧紧挨转录起点的一段长度为20200bp的非编码的核苷酸序列,其功能是与RNA聚合酶结合形成转录起始复合物。原核生物的启动子大约4050bp,其中包含有转录的起始点和两个区(-35区和-10区)。起始点是DNA模板链上开始进行转录作用的位点,通常在其互补的编码链对应位点(碱基)标以+1-10区是RNA聚合酶核心酶与DNA分子紧密结合的部位,大多包含有6bp的共有序列,即:TAT AAT-35区是RNA聚合酶σ因子识别DNA分子的部位,其共有序列为:TTGACA

终止子(terminator)是位于一个基因或一个操纵子的末端,提供转录停止信号的DNA区段。与启动子不同的是终止子仍能被RNA聚合酶转录成mRNA。大肠杆菌的终止子分为两类:一类是不依赖于RhO蛋白质辅助因子(现在一般称做ρ因子)而能实现终止作用,这类终止子称为强终止子;另一类是依赖于ρ因子才能实现终止作用,这类终止子属于弱终止子。

在原核生物中只有一种RNA聚合酶。所有原核基因,包括编码蛋白质的基因和编码RNA的基因都是在同一种RNA聚合酶的作用下进行转录。

2 真核基因的结构 

与原核基因一样,一个完整的真核基因,不仅包括编码区,还包括编码区两侧的调节序列。真核生物的蛋白质编码基因以及某些tRNA基因的编码序列,都被一种叫做内含子(nitron)的非编码序列所间断。在基因的表达过程中,内含子便从初级mRNA分子中被剪接掉,形成成熟的功能mRNA

另一个特点是真核生物有三种不同的RNA聚合酶,各自负责转录不同类型的基因。这三种 RNA聚合酶分别叫做PolPolPol

Pol转录rRNA基因(5SrRNA除外),Pol转录蛋白质编码基因,Pol转录编码众多小RNA(包括 tRNA 5S rRNA)的基因。真核生物中这三种 RNA聚合酶所识别的启动子和调控序列在结构上存在一定的差异。

真核生物编码蛋白质的基因启动子,与原核生物的启动子相似,也具有两个高度保守的共有序列。另外,还有一部分DNA序列能增强或减弱真核基因转录起始的频率,这些区域称为增强子(enhance)和沉默子(silencer)。

增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列,长度一般为100200bp。增强子是1981年首先在SV40病毒的早期基因的上游发现的。目前,在病毒、真菌、植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子的存在。  

沉默子是在酵母交配型座位中首次发现的。目前,在动物、人类的细胞中都发现有沉默子。沉默子属于负调控元件,可不受距离和方向的限制,并可对异源基因的表达起作用。沉默子在真核生物细胞中对成簇基因的选择性表达起重要作用。 

真核基因的 3末端序列区具有终止转录作用的信号以及 mRNA 3末端转录后加工的信号。许多基因都是在特定的序列处终止转录,除了某些组蛋白的mRNA之外,大多数的mRNA分子的3末端都有一段polyA)尾巴,它的长度一般为200个核苷酸,不过酿酒酵母的大多数mRNA转录物则只有50个核苷酸左右的polyA)尾巴。 

2. 基因概念的不断发展和更新

随着重组DNA技术和DNA序列分析技术的发展,对基因的认识又有了新的发展和更新,主要是发现了重叠基因、断裂基因、移动基因(转座因子)、假基因等新现象。

 重叠基因(overlapping gene

重叠基因是指一个基因的核苷酸与另一个基因的核苷酸之间存在着一定程度的重叠现象。重叠基因有两种类型:第一种类型是一个基因的核苷酸序列完全包含在另一个基因的核苷酸序列之中;第二种类型是一个基因的末端密码子与另一个基因的起始密码子之间的少数核苷酸之间的重叠。基因重叠现象最初在测定X174噬菌体DNA的核着酸序列时发现,后来在许多细菌中也发现有基因重叠现象。

 断裂基因(spht gene

所谓断裂基因就是基因的编码序列在 DNA分子上是不连续的,为不编码的序列所隔开。编码的序列称为外显子(exon),不编码的序列称为内含子(nitron)。断裂基因在表达时,RNA聚合酶先将该基因的全部遗传信息(包括外显子和内含子)转录成为一条长的前体mRNA,又叫核内不均一RNAhnRNA),然后经过删除和连接,除去内含子,便形成了成熟的mRNA分子,最后才翻译成蛋白质。

高等真核生物的基因多数都有内含子,原核生物的基因一般没有内含子。断裂基因分布很广,真核生物的绝大多数结构基因都含有内含子,内含子是基因的组成部分,也是遗传物质。在不同的基因中,内含子的大小和数目变化很大,有的只有一个或少数几个,有的可多达十几个。一般认为,断裂基因的存在有利于生物的变异、进化,有利于储存较多的遗传信息。 

 假基因 pseudogene

假基因是与功能性基因密切相关的DNA序列,但由于缺失、插入和无义突变失去阅读框架而不能编码蛋白质产物。

⑷移动基因(movable  gene

移动基因又叫做转座因子(transposable  element)。由于它可以从染色体 DNA上的一个位置转移到另一个位置,因此在文献上有时也形象地称之为跳跃基因(jumPing gene) 

二、基因组学

基因组学是研究生物体基因和基因组的结构组成、不稳定性及功能的一门学科。随后又把基因组学分成结构基因组学(structural genomics)和功能基因组学(functional genomics)。前者指研究基因和基因组的结构,各种遗传元件的序列特征,基因组作图和基因定位等。后者则着重研究不同的序列结构具有的不同功能,基因表达的调控,基因和环境之间(包括基因与基因之间,基因与其他DNA序列之间,基因与蛋白质之间)相互作用等。

此外,目前对生物基因组的研究,又根据研究对象和具体目标而分别出现了人类基因组研究、病原体基因组研究、微生物基因组研究、植物基因组研究、家畜基因组研究、模式生物基因组研究、药物基因组研究、比较基因组研究等,名目繁多,举不胜举。

那么什么是基因组呢?

所谓基因组(genome)是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质。就大多数细菌和噬菌体而言,它们的基因组是指单个染色体上所含的全部基因,而二倍体真核生物的基因组则是指单倍体(配子或配子体)细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因。除此之外,还有细胞器基因组。如动植物细胞都有的线粒体基因组,以及植物细胞中的叶绿体基因组。

一般来说,微生物(无论是原核微生物还是真核微生物)基因组一般都比较小,其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2只有3000bp,含3个基因。在对各种生物染色体分子的大小和基因组的研究中,总结出可以简单地用 103bP106bP 109bp去估计病毒、原核生物和真核生物基因组的大小差别。如¢X174噬菌体是单链环状 DNA,长度为 5.3× 103bp,大肠杆菌染色体 DNA 4.7 ×106bp,人的染色体 DNA 3.2 ×109bp(表 17) 

三、大肠杆菌的基因组

1997年完成了大肠杆菌K12的全基因组的测序工作。大肠杆菌K-12基因组的大小为4.6 ×106bp,,基因组中87.8DNA编码蛋白质,0.8编码RNA0.7是非编码的重复序列,约11%左右参与调节和其他功能。

在大肠杆菌基因组中共有4288个基因,其中1853个是以前已经报道过的基因,而其余则是功能未知的新基因。基因的平均长度是951bp;有4个基因的长度为45005l00bp51个基因的长度为30004500hp381个基因的长度小于300bp。最大的基因其长度为7149bp(功能未知)。图130是大肠杆菌环状染色体的基因图谱。下面对大肠杆菌基因组的主要特征作一介绍。

大肠杆菌基因组的主要特征:

1.编码蛋白质的基因

转录单元(operon)是指由启动子、结构基因及其终止子组成的一段DNA顺序。如果功能上相关的几个结构基因前后相连,利用一个共同的启动子和终止子,这种转录单元被称为操纵子(perator)。操纵子通常是先被转录成一条大的mRNA,再由同一条mRNA翻译出几个结构蛋白。

在大肠杆菌中,染色体上的许多基因是以操纵子的形式组织起来的。这种操纵子是原核生物基因组的一个特点,另外,还有不少功能相关的蛋白质的基因并不簇集在一起,而是分散排列在整个染色体DNA的不同区域,如与大肠杆菌染色体复制有关的十多个酶基因就是分散在染色体上的。

对大肠杆菌K-12的基因组全序列分析表明,共有2584个转录单元,其中2192个(占73%)只有一个基因,16.62个基因,4.63个基因,64个或4个以上基因。     

所有转录单元都至少含有一个启动子,有些含有2个启动子,还有些含有3个或3个以上的启动子。上面的数据也说明蛋白质基因通常以单拷贝形式存在。

2.最终产物是RNA的基因组

(1) rRNA基因   一般来说,大多数细菌的rRNA基因(rDNA)都是以转录单元(也称为rrn位点)的形式组织在一起的。一个转录单元中含有三个 rRNA基因,即 5S rDNA16SrDNA23SrDNA,它们以16S-23S-5S的顺序串联排列,长度约5kb,转录时先形成1个大的 rRNA前体,再形成成熟的 16S23S 5rRNA。另一个特点是rRNA的拷贝数多。大肠杆菌染色体上有 7个以16S-23S-5S顺序排列的rDNA转录单元。在大肠杆菌的7rDNA转录单元中,有6个分布在染色体DNA的双向复制起点oriC 附近,而不是在复制终点附近(图131)。 

(2) tRNA基因   tRNA的种类远比rRNA的种类多,一般原核生物有3040tRNAtRNA基因多数以基因簇的形式存在,它们簇集在染色体复制起点的附近,一般一个转录单元含有23tRNA,同受一个启动子的控制。有些转录单元只含有一个tRNA基因。在大肠杆菌K-12中,有86tRNA基因,形成43种转录单元。

(3) 重复序列 所有生物的基因组中都存在重复序列。原核生物基因组中除了一些多拷贝基因,如 rRNA基因、tRNA基因、插入因子 IS等外,还存在有很多的重复序列,其中大多数是短重复序列,主要的重复序列有RhSREPERICChi(位点)等。

RhS是大肠杆菌K12中最大的重复序列,长度为5.79.6kb,它可以编码141kD的大蛋白,但不具已知功能,菌株比较表明可能是移动因子。大肠杆菌染色体上有5RhS,占整个基因组的0.8

基因外重复的回纹序列(repeated xtragenic palinodromeREP)是一段 38bp的反向重复序列,它能形成一个稳定的茎环结构,一般位于多顺反子的转录单元之间的区域。大肠杆菌染色体上有581REP序列,占整个基因组的0.54%。 

肠杆菌基因间的重复的一致序列(enterobacteria repetitive Intergenlc nsensusERIC)是一段长为126bP的反向重复序列,其特点与REP序列相似。普遍存在于细菌的基因组中,特别是肠杆菌群(enterobacteria)中,位于可转录的非编码区。

Chi5GCTGGTGG-3)是大肠杆菌染色体的另一个重复序列,是易发生同源重组的位点,具有8bp平均5.5 bp就有一个Chi位点,大肠杆菌K-12染色体上有 1009Chi位点。

4)插入序列和转座子 插入序列是大肠杆菌染色体的重要组成成分,如在K-12染色体上有IS1IS2IS3IS4IS5IS150IS186IS30IS600 IS911IS除插入失活外,还能引起染色体缺失、重复和倒位。转座子也是大肠杆菌染色体 DNA的重要组成成分。

5)噬菌体及其噬菌体残迹 大肠杆菌K12除具有λ噬菌体外,还有一些缺陷性噬菌体和隐蔽原噬菌体,后两者都丧失了裂解生长和产生噬菌体粒子的基本功能。

总之,根据基因的功能,可将大肠杆菌的基因分为多个功能组(表1-8)。

四、¢X174噬菌体的基因组

X174噬菌体的基因组是一种较小的噬菌体,只有T类噬菌体的14,呈20面体颗粒状。其DNA为单链环状,共有 5386个核苷酸。其序列于1977年由英国剑桥大学的Sanger分析确定。为此,Sanger第二年获得诺贝尔奖。

X174噬菌体的基因组的最显著特征是有基因重叠现象。¢X174噬菌体共有 11个基因,依次为基因A、基因A*、基因B、基C、基因D、基因E、基因J、基因F、基因G、基因H和基因K(图1-32)。基因B、基因K、基因E分别在基因A、基因C、基因D之中,但使用不同的阅读框架(图133)。

基因A*虽然与基因A使用相同的阅读框架,但却在A基因中部才开始转录。类似的基因重叠现象也存在于其他噬菌体及某些真核生物的病毒中。另外,¢X174噬菌体的DNA绝大部分用来编码蛋白质,不翻译出来的部分只占4%(2175386),其中包括基因之间的间隔区和一些控制基因表达的序列。

五、真核生物的墓因组及其特点

1.真核生物基因组的结构特点

①基因组的分子量大,低等真核生物大约107108p(比细菌大10倍以上),而高等真核生物达到5×1081010bP,有些植物和两栖类可达 1011bP,哺乳动物大于2 ×109bP,它们可以编码100万个基因。

②真核生物往往有很多条染色体,一般呈线性。每个染色体的 DNA又具有很多复制起点。细胞核DNA与蛋白质稳定地结合成染色质的复杂结构。

③核基因组DNA存在于细胞核内,由于核膜将细胞分隔成细胞核和细胞质,在基因表达中转录和翻译的空间位置是分隔的,不偶联的。

④基因组有大量不编码蛋白质的序列。真核生物基因组的最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。

⑤真核生物的蛋白质编码基因往往以单拷贝形式存在。功能相关的基因一般不以操纵子的形式存在。

2.真核生物基因组中的DNA序列特征

1)非重复序列(单一序列)    

所谓非重复序列指在一个基因组中,这些序列一般只有一个或几个拷贝.它占DNA总量的40%~80%。如牛细胞中占55%.小鼠中占70%.果蝇中占79%。不重复序列长约7502000bp,相当于一个结构基因的长度。实际上,大多数结构基因都属于不重复序列,也就是说是单拷贝的。

2)中度重复序列     

中度重复序列是指在一个基因组中有几十到几百拷贝,占总DNA10%~40%,如小鼠中占20%,果蝇中占15%。各种rRNAtRNA、可移动基因、重复序列家族以及某些结构基因如组蛋白基因等都属于这一类。这些家族成员往往以大体上固定的方式与非重复DNA序列相间分布。目前认为,多数相间分布的中度重复 DNA序列与基因表达的调控有关,可能是DNA复制和转录有关的蛋白质因子的识别位点。 

3)高度重复序列——卫星DNA      

   这类DNA只在真核生物中发现.占基因组的 10%~60 %,由6100个碱基组成,在DNA链上串联重复几百万次。卫星DNA由长串联重复序列组成.一般位于染色体上的异染区域.也可分散在核基因组的多个位置上,染色体的端粒也是由卫星DNA组成。卫星 DNA是不转录的,其功能不明.可能与染色体的稳定性有关。属于基因外的 DNA重复序列。

3.基因家族与基因簇

真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因,这样的一组基因称为基因家族(gene family)。其中大部分有功能的家族成员之间相似程度很高,但也有些家族成员间的差异很大,甚至还有无功能的假基因(pseudogene)。

基因家族的成员在染色体上的分布形式是不同的.其中一些基因家族的成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位、定位于染色体的特殊区域上形成基因簇(gene cluster,而另一些基因家族的成员在整个染色体上广泛分布,甚至可存在于不同的染色体上。

1rRNA基因簇 

rDNA是基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族,重复次数在 103105。真核生物中有 5.8S1718S2528S5S四种 rRNA、其中5.8S1718S2528S rDNA构成一个转录单位,它们在基因组中串联排列形成 rDNA重复单元(图1-34)。 

虽然在一些真核生物中其rDNA的结构基本特征相似,但其长度差别很大。例如酵母约9kb,哺乳动物可达14 kb(图 1-35和表 1-9)。另外,多数真核细胞核中,rRNA基因成簇分布在一条或几条染色体上。例如酵母单体倍体细胞有140rRNA基因以串联形式排列在第7号染色体上。 

5S RNA基因120bp 5.8S18S 28S rRNA基因是分开的。每5S DNA与一段非转录间隔区组成一个5S DNA重复单位。一个5S DNA长约 375bp 

2tRNA基因 

真核细胞中的tRNA基因几乎都是重复的,每种tRNA基因数从几百个甚至几千个不等。如酿酒酵母中有275tRNA基因、果蝇有600900拷贝、爪蟾约8000拷贝等。真核细胞如此众多的tRNA基因,是分散在不同的染色体中,即使携带同一种氨基酸的不同tRNA基因的同功受体tRNA基因也往往位于一个以上的染色体部位,通常构成单个转录单位,但不同的tRNA基因又是成簇排列。 

3)结构基因 

一个结构基因家族不仅需要编码相关的蛋白质,而且需要相关或相同功能基因的多拷贝,以保证不同时期不同细胞对产物的需要量。例如组蛋白基因簇。在许多生物中,编码HIH2AH2BH3H4的这五种组蛋白的基因彼此靠近构成一个转录单元,长约6000bp,基因间由非转录DNA序列间隔。许多这样的转录单元串联排列在一起,构成组蛋白基因簇。

组蛋白基因簇中的转录单元的数量依生物而异,鸡约有10个,哺乳动物有20个,果蝇约有100个,海胆约为300600个之间(图136)。 

 

2.基因突变的类型、符号和规律

一、基因的符号

最初的基因符号是以代表某一相关性状的英文名称的第一个大写字母来表示的。现在采用以下统一的命名规则。

①每个基因用斜体小写的三个字母来表示,这三个字母取自表示该基团特性的一个或一组英文单词的前三个字母。

②产生同一表型的不同基因,在三个字母后用不同的大写斜体英文字母表示。如 trp代表色氨酸基因,各个不同的色氨酸基因分别用trpAtrpB来表示。

③突变型基因的表示方法是在基因符号的右上角加-.如亮氨酸缺陷型用leu-来表示。抗药性基因是在基因符号的右上角加r表示抗性,加s表示敏感,如链霉素抗性基因则表示为strr.

某一突变型基因的表型一般也是用相应的正体三个字母表示,不过第一个字母大写。例如乳糖发酵缺陷型的基因符号是lacZ-,那么其表型符号便写为LacZ-

⑤当染色体上存在缺失时可用△表示,缺失部分放在△符号的括号中.例如△(lacpro)表示从乳糖发酵基因到脯氨酸是因这一段染色体发生了缺失。

二、基因突变的类型

基因突变可从突变发生方式和突变方式引起的表型改变和遗传物质改变等方向进行分类。

1、按突变体表型特征的不同,可把突变分为以下4个类型。   

①形态突变型。指发生细胞形态变化或引起菌落形态改变的那些突变型。例如,失去产生孢子、荚膜和鞭毛的能力。

②生化突变型。指没有形态效应的突变型。最常见的是营养缺陷型,其生长必须在培养基中加某种物质。另外,对抗生素增加耐性的抗性突变等都属于生化突变。

③致死突变型。由于基因突变而造成个体死亡或活力下降的突变型。

④条件致死突变型。在某些条件下能成活,而在某些条件下是致死的突变型。最典型的是温度敏感突变。例如T4噬菌体功温度敏感突变型在25时能在大肠杆菌细胞内正常生长和繁殖,形成噬菌斑,但在42时就不能生长。

2、按突变所引起的遗传信息的改变,可把突变分为:

①错义突变(missense mutation)。突变造成一个不同氨基酸的置换。

②同义突变 samesens mutation)碱基突变后编码的氨基酸与野生型的氨基酸相同。

③无义突变(nonsense mutation)。当碱基突变后形成终止密码子,使蛋白质合成提前终止。无义突变分为琥珀突变(amber)、赭石突变(ocher)和乳白突变(opalumber)。琥珀突变是指碱基突变后形成的终止密码子为UAG;赭石突变是指碱基突变后形成的终止密码子为UAA;乳白突变是指碱基突变后形成的终止密码子为UGA

3、根据遗传物质的结构改变,可分为碱基置换、移码、DNA片段插人和缺失。

4、根据突变发生的方式,可分为自发突变和诱发突变。

三、遗传学上常用的几个突变株

1.营养缺陷突变株(auxotrophic  mutant

指由于代谢障碍而成为必须添加某种物质才能生长的突变株。例如,必须在培养基中添加腺膘呤才能生长的突变株称为腺瞟呤突变株,用Ade-表示。相反,在不添加腺膘呤的培养基中也能生长的,称为野生型菌株,用Ade+表示。由于野生型菌株在基本培养基和完全培养基上均可生长,而营养缺陷突变株只能在完全培养基上生长,因此两者很容易区别开来。

2.温度敏感突变株(temperature sensitive mutan

指可在某一温度下生长而在另一温度下不生长的突变株。通常,这类突变是由于某一蛋白质的氨基酸发生改变,造成蛋白质或一级结构的改变。这样的蛋白质(或酶)只有在许可的温度下才能维持其空间结构,具有正常的生物活性。当达到限制温度时,该蛋白就要变性并失去功能。例如,大肠杆菌野生型菌株在2040范围内能很好地生长,而温度敏感突变株在42下则不能生长

3.抗性突变株(resistant mutan

指对某种药物具有一定抵抗能力的突变株。例如,某一链霉素抗性突变株可以在加人1000Uml链霉素的培养基上生长,而野生型则不能生长。

四、基因突变的规律

无论哪种突变,即自发突变或诱发突变,形态突变或生化突变等,都具有下面几个特征。

1.随机性

就微生物的某一群体而言,基因突变的发生从时间、个体、位点和所产生的表型变化等方面都带有比较明显的随机性。

2.独立性

在微生物群体中,基因突变是独立发生的,某一个基因的突变与另一个基因的突变之间是互不相关的独立事件。例如,巨大芽抱杆菌对异烟姘产生抗性的突变率是 5 X 10-5,对对氨基柳酸抗性突变的突变率是 IX 10-6,同时兼有两种抗性的几率为 8 X 10-10,后者大约等于二者的乘积。这说明突变的发生不仅对于细胞来说是随机的,对于基因来说也是随机的。

3.稳定性

基因突变的实质是遗传物质发生改变的结果。因此突变型基因和野生型基因一样,具有相对稳定性的结构,也是可遗传的。如筛选到的抗链霉素的突变株.在没有链霉素的培养基上连续传代无数次,他的抗性也没有丝毫改变。

4.可逆性                                             

野生型基因可以通过突变而成为突变型基因,同样,突变型基因也可以通过突变而成为野生型基因。例如.野生型菌株通过基因突变可以变为抗链霉素的突变型菌株:抗链霉素的突变型菌株又可以回复突变为对链霉素敏感的野生型菌株。一般把野生型基因变为突变型基因的过程称为正向突变,突变型基因变为野生型基因的过程称为回复突变。

正向突变得到的突变株叫突变株,回复突变得到的菌株就叫做回复突变株。从表型上来看,回复突变株与野生型菌株没有明显的差异。但从基因型来分析,回复突变产生的原因可分为三类:第一类是真正的基因回复突变.即原突变位点的回复:第二类是由同一基因不同位点的突变所导致的基因内抑制突变:第三类是由于基因间不同位点发生的基因突变而抑制了原有突变基因的表达,这种情况又称作抑制基因突变型。

5.稀有性

突变的稀有性是指在正常情况下,突变率往往是很低的。所谓突变率是指在一个世代中或其他规定的单位时间内,在特定的环境条件下,一个细胞发生某一突变的概率。表2-1是一些细菌对不同药物或噬菌体的抗性突变的自发突变率。

3. 质粒的发现和命名

一、质粒的发现

大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒,是基于它能够诱导染色体在菌株间的转移而得以揭示的。20世纪50年代,日本学者报道了志贺菌(Shig6lla)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中,人们集中研究了抗性质粒,尤其是流行病学和抗性的机制。同时也陆续发现各种细菌携带质粒,且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。

70年代末,随着遗传工程的崛起,质粒作为载体已被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。同时,也用遗传工程和分子生物学的研究方法,对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析,使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。

二、质粒的命名原则

质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名,如 F因子(fertility factor,致育因子)、R质粒(resistance  factor,抗性质粒)和Col质粒(colicin,大肠杆菌毒素质粒)等。随着研究工作的深入和发展,愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现,由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。

直至 1976Novick等才提出并逐渐形成了一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则,其规则是:质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成,第一个字母一律用小写p表示,后两个字母应大写,可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字,用于区分同一类型的不同质粒,如pUC18pUC19等。

 

4.质粒的检测

质粒DNA与宿主染色体DNA共存于同一细胞中,并携带   多种编码某些遗传特性的基因。

目前用来检测质粒的方法主要是根据质粒两方面的特性,即遗传学特性和分子结构特性。

所谓遗传特性是指质粒具有与染色体DNA不同的特征,如:质粒具有独特的表型效应、能独立地从一个细胞转移至另一个细胞、能人为地被消除而不影响宿主的生存等。根据这些遗传学特性,可采 用质粒消除、遗传转移、分子杂交等方法初步检测菌株是否含有质粒。

另外,从分子结构上来讲,由于质粒DNA在细胞中处于共价、闭合、环状的超螺旋状态,因而与染色体相比,它们对碱、高温等理化因子处理有更强的抗性。因此根据这些特性可很容易地对宿主中的质粒进行检测、分离和纯化。

一、质粒消除(curing

所谓消除,是用理化因子或生物学方法消除质粒,观察寄主细胞是否丧失某些性状。消除质粒的方法目前主要有两种:一种是用物理化学因子;另一种是生物学方法,即原生质体形成与再生。

1.理化因子消除法

细菌质粒能经某些理化因子的处理而消除,从而有效地获得失去了质粒的细菌。具有消除作用的理化因子有:吖啶橙、溴化乙锭、利福平、亚硝基胍、高温、紫外线等(表5-1)。常用的试剂是吖啶橙,但吖啶橙的应用范围很窄。有时还应用其他化合物和手段。

上述消除质粒的理化因子实际上也是引起染色体基因突变的诱变剂,因此用这些因子处理细胞后,某一遗传性状的丧失,既有可能是质粒消除的结果,也可能是染色体基因突变的结果。

质粒的消除受多种因素的影响,例如消除剂是否合适、宿主状态、消除条件等。如F+质粒用吖啶橙消除时,如果在 42℃条件下,消除率可达100%,如在常温下消除率很低,但对整合状态的Hfr则基本无效。 

消除作用并不是药物对于质粒DNA的破坏作用,它有两种作用机制:一种是对质粒本身的复制和分离产生抑制作用,从而在细菌生长繁殖过程中逐步淘汰;另一种是选择性抑制带有质粒的菌生长。 

2、原生质体诱导的质粒消除

所谓原生质体诱导消除法是使待消除质粒的菌株在一定条件下(如用溶菌酶处理)形成原生质体,在再生后生长的菌株中可出现高频率(约94%)质粒消除菌。这种方法已在其他许多菌的质粒消除中获得应用。如葡萄球菌、枯草杆菌、链霉菌、沙门菌等。

有关原生质体诱导的质粒消除机制目前还不十分清楚,有人认为细菌去掉细胞壁形成原生质体时导致了质粒消除。因为有实验表明,用高浓度的溶菌酶长时间处理细胞,可导致质粒消除。另外也有人认为质粒是在原生质体再生过程中丢失的。根据目前的各种实验表明这二种看法在原生质体诱导质粒的消除中都起着某些作用。

二、遗传转移

有些质粒(如F质粒和R质粒)带有转移基因,能够通过接合作用向受体菌转移。小质粒(如ColE1)受基因容量的限制一般没有自我转移能力,但却可以通过转化、诱动转移或电转化等特殊手段来进行质粒的转移。质粒转移的成功与否,还取决于供、受体菌之间的接合作用能力及质粒在受体菌中复制存在的可能性。

三、分子杂交

在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下,利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交,来检测其菌株是否含有该种质粒,这也是目前用于质粒检测的重要手段。例如Kronstad等人用克隆了的苏云金杆菌晶体毒素蛋白基因的限制酶切片段作探针与各菌株总体质粒制备物进行杂交,研究了14个亚种22个菌株的晶体蛋白质基因的定位,证实有9个亚种17个菌株的晶体蛋白质由质粒编码。

四、质粒的分离、检测与纯化

质粒的消除或转移试验只能间接地证明质粒的存在并用于分析质粒与其控制的表型性状的相关性。质粒存在直接证明取决了从宿主细胞中直接检测、分离和纯化出质粒DNA。由于质粒DNA在细胞中处于共价、闭合、环状的超螺旋状态,因而与染色体相比,它们对碱、高温等理化因子处理有更强的抗性。 

常用的质粒分离方法主要是碱变性法。其主要步骤包括:①菌体的培养和收集:一般采用丰富培养基对菌体进行培养,当细胞生长到对数后期离心收集细胞。②溶菌:一般用溶菌酶去壁以形成原生质球或原生质体。③碱变性处理:在SDS等表面活性剂存在下加 NaOH液使 pH升至 12.4可使菌体蛋白质和染色体DNA均不可逆变性而与质粒DNA分开。④离心分离:经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白和染色体DNA一道沉淀,上清液中主要是质粒DNA,经乙醇沉淀后,可获得质粒DNA

质粒DNA的进一步纯化和检测可以采用以下三种不同的方法:

1.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是根据分子量的大小和电泳后呈现的带型将质粒DNA和染色体DNA区分开来。从分子量上来说,其移动速度与分子量的大小成反比,即分子量越大,移动速度越慢。从DNA构型上来说,一般同一分子量、不同构型的DNA的电泳速度排列是:超螺旋、共价、闭合环状DNAcccDNA)>缺刻环状DNAoc DNA)>线性 DNAL DNA)。

从电压与电流强度上看,一般电压愈高、电流强度愈大时,DNA的电泳速度愈快;但电泳速度过快会降低琼脂糖凝胶的有效分离范围,并由于电泳过程中放热而使凝胶升温。从琼脂糖凝胶的浓度来说,常用的琼脂糖浓度为03%~20%。一般地说,琼脂糖凝胶浓度越大,不同分子量DNA的电泳距离差异越小。因此检测小质粒或DNA分子宜用较高浓度的琼脂糖,检测大质粒或大的DNA分子宜用低浓度的琼脂糖,常用琼脂糖浓度与分离DNA大小的关系见表5-2

电泳后的凝胶一般用 0.5μg/ml的荧光染料溴化乙锭 ethidiu bromideEB)染色,EB具有特殊的扁平构型,能通过与碱基的交联作用而与DNA结合。在UV照射下,它能发出橙红色可见光而显示出DNA区带的电泳位置。琼脂糖凝胶电泳不仅可以检测某菌株是否含有质粒,而且也可以用来测定质粒分子量的大小:即在进行电泳时,用已知分子量的质粒做标准,根据移动距离判断分子量的大小。

2、氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心

氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心是根据密度的不同将质粒DNA和染色体DNA区分开来。由于氯化铯(CsCl)溶液在超速离心力的作用下能形成密度从1.151.80g/ml的连续密度,因而常用于分离纯化DNA和进行DNAG+C含量的测定。考虑到同一微生物细胞内的染色体DNA和质粒DNAG+C含量的差异有限,需要在CsCl溶液中加入适量的溴化乙锭,以扩大染色体与质粒DNA在密度上的区别。溴化乙锭可插入DNA分子而降低其密度。

质粒DNA在分离过程中一般仍保持共价、闭合的环状状态,DNA分子无自由末端,所以与EB染料的结合量较少,其密度降低也较少;再加上EB的结合还会通过增加质粒DNA分子的内聚力而使构型进一步扭曲并转为更紧密的缠结状态,因而能减少梯度离心时的沉降阻力而使质粒DNA成为离心时的重带。相反染色体DNA被从细胞中提取后由于断裂成线性,其两端可以自由转动而使分子内的紧张状态完全松弛,所结合的EB染料也少,密度更小,离心时的沉降阻力加大而形成位于质粒DNA之上的轻带。

另外,CsCl-EB密度梯度离心也是提纯质粒的最常用的方法。用这种方法可以很好的将分子量相同的超螺旋环状、带切口环状及线状质粒分开(图5-3)。因此,CsCl-EB密度梯度离心不但可用于分离、纯化和检测质粒DNA,而且还适用于大量制备高纯度的质粒DNA,以满足进一步的酶切、转化及制备DNA探针等研究工作的需要。本法由于需要较昂贵的超速(>35000rpm)离心机、较长的离心时间(>8h)、较昂贵的CsCl药品等而在普及应用中受到限制。

3、电镜观察

经纯化后的质粒DNA经电镜样品的特殊制片、重金属离子染色等处理后可用于透射或扫描电镜观察。在高倍放大条件下,可在电镜下直接观察到呈环状双链的质粒DNA分子,并很容易与线状的染色体DNA片段分开。通过仔细测量电镜照片中标准质粒DNA一供试质粒DNA在相同放大倍数下的长度,可以较准确地推算出去分子量的大小。

5. 链霉菌遗传

链霉菌中的转座因子:链霉菌中的转座因子包括插入序列(IS)、转座子(transposon)及可转座的噬菌体。表6-是天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中转座因子,这些转座因子有的位于染色体上,有的位于质粒上。

需要指出的是,天蓝色链霉菌的IS1172.5kbmini-circle,能整合在染色体的特异位点上,具有环状的转座中间体,其具有抗性标记的衍生物被用做整合型载体。变铅青霉素菌66中的IS493和弗氏链霉菌的Tn4556是两个随机整合 的转座因子,被改造后用来对链霉菌进行转座诱变。

链霉菌中的噬菌体: 链霉菌中既有温和性噬菌体也有烈性噬菌体,有些噬菌体的寄主范围窄,而有些噬菌体的寄主范围广泛。由于链霉菌属于土壤细菌,因此链霉菌的噬菌体最容易从土壤中分离而得到。已经从很多链霉菌中分离到噬菌体,如天蓝色链霉菌中的¢C31噬菌体、委内瑞拉链霉菌(Svenezuelae)中的¢SV1噬菌体、龟裂链霉菌中的RP2RP3噬菌体。这些噬菌体在链霉菌的基因交换中起重要作用。

SV1噬菌体经过改造后被用来进行普遍性转导,能介导对许多营养缺陷型菌株转导产生原养型菌落。

C31是链霉菌的广寄主范围的温和噬菌体,在形态和其他特征上与大肠杆菌λ噬菌体类似。¢C31既能溶源又能裂解,噬菌体通过att位点整合到宿主染色体的特异位点上而形成原噬菌体。其DNA长度为41.4kbGC含量为 63%,具有部性末端,全序列已被测定。通过对4C31的一系列改造,已经构建了一系列克隆载体,被广泛地应用在链霉菌的基因克隆中。

链霉菌的遗传分析方法和基因连锁图的制作:链霉菌的杂交要求把两个带不同遗传性状的营养缺陷型亲本菌株在琼脂平板上混合培养,在混合培养过程中就会发生接合作用,并伴随着遗传重组,然后对杂交好几天后所产生的一系列的最终产物涂布在选择性的培养基上,根据筛选重组子进行遗传分析。

在天蓝色链霉菌及其他链霉菌的基团定位中,常用的方法是4×4杂交方法、异质系克隆和平板杂交等。下面就分别介绍这几种方法的原理。

14 × 4杂交”方法(four-on-four cross

该方法是将各含有2个缺陷型的两个亲本进行杂交,杂交后的孢子通常以不同的稀释度被涂布到含有抗生素或缺乏其些生长因子的4种选择性培养基上,这些培养某能使重组子生长而不能使亲本生长。然后通过对不同的培养基上进行菌落计数,即可计算各种重组或转移所发生的频率。

这种方法最初于1972年由Hopwood在天蓝色链霉菌中开始应用,后来被广泛的用到其他链霉菌的杂交分析中,如淡青链霉菌、龟裂链霉菌、变铅青链霉菌、吖啶霉素链霉菌以及地中海诺卡氏菌等。 

首先,我们看一个如下的实验。

将基因型为ade his++菌株的孢子与基因型为++arglys菌株的孢子混合接种于完全培养基中,25下培养34天。待形成孢子后,把单位体积的孢子悬浮液涂布在下列4种选择性培养基上:①腺嘌呤+精氨酸;②腺嘌呤+赖氨酸;③精氨酸+组氨酸;④组氨酸+赖氨酸。每种培养基上所长出的菌落(全部或抽样)就可参照于那种培养基上的非选择性标记而归类。这样在每一种培养基上即可有4种可能的基因型。根据那种培养基上的菌落总数,就可计算出单位体积中每个基因型的数目(表6-7)。

2、异质系克隆(heteroclone

在天蓝色链霉菌A3(2)及其他几个种链霉菌中,曾用过异质系克隆进行遗传定位。异质系克隆是指在某些放线菌中,两个多重标记的营养缺陷型亲本杂交时,供体染色体片段进入受体细胞后形成的局部杂合核在分裂过程中发生染色体交换和减数,结果在同一菌丝体上形成单倍重组体孢子。这样由一个杂合核演化繁殖形成的菌落叫异质系克隆(heteroclone)。

其产生的孢子是重组子和亲本基因型的总和。由于异质系克隆产生的孢子大多不能在基本培养基上生长,采用不同的选择性培养基可以鉴别出不同类型的单倍重组体,根据其频率就可以用来做链霉菌的遗传图谱。

这一异质系菌落的来源可以用图6-17来解释,图中实线圆圈表示UF菌株的染色体,用外面实线表示进入UF菌株的NF 染色体片段[6-17a)。假定NF染色体片段进入UF细胞后,并不经过二次交换而整合到UF染色体上,而只在b区发生一次交换,这样就得到一个线状染色体。异质系染色体在进行复制过程中,可以再次在abcf等各个区域中发生第二次染色体交换,通过这些交换可以形成环状的染色体。由于交换位置不同,UF得到NF染色体的片段不同,因而就形成了不同基因型的分生孢子,有这些分生孢子便长成不同基因型的重组体。

3.平板杂交

此方法通常包括两个步骤。第一步是把长有一系列待测菌株的母平板影印到接种有同一亲本且已长成孢子“坪” 的非选择培养基(完全培养基或R2YE)平板上进行杂交。第二步是杂交平板长好孢子后,再影印到一种或多种选择培养基上,回收重组子。在一个平板上,常常可以测定多至20个菌株。这就开辟了利用平板杂交迅速定位基因位点的可能性。

链霉菌与大肠杆菌之间的接合作用:

通过大肠杆菌进行接合作用时,需要首先人工构建能在大肠杆菌和链霉菌中都能进行复制的双功能载体(即穿梭载体),接着将外源基因连接在该载体上,然后通过大肠杆菌与链霉菌间的接合作用,就可将外源基因导人链霉菌中,这是进行种间杂交的一种有效方法。这种载体一般是含有革兰阴性菌质粒RP4oriT位点的可移动质粒,利用大肠杆菌供体提供的转移功能,能介导大肠杆菌和链霉菌杂交。常用的大肠杆菌是S17-1(含有整合的RP4质粒)。 

利用大肠杆菌进行的接合作用将外源DNA转移到链霉菌或其他放线菌有下列优点。①方法简单,不需要制备原生质体;②能够利用许多通用的oriT(转移起点)载体,进行位点专一性或定向插入并与染色体整合;③由于这些载体能在大肠杆菌中复制,容易构建所需要的重组物 

6. 酵母线粒体基因组及其遗传

一、呼吸缺陷突变株

酵母可以通过呼吸和发酵这两种代谢形式来取得能量,在有氧条件下进行呼吸,在氧缺少的条件下进行发酵。1949年法国学者Ephrussi等人用吖啶黄处理野生型酵母,发现可以以很高的频率获得在好气条件下生长缓慢的突变株。该突变株由于生长缓慢,所以形成的是小菌落,因此称之为小菌落突变株(petite mutant)。 

后来的研究表明,小菌落突变共有三种不同的类型:第一类是由染色体上的基因突变产生的,它在与野生型菌株杂交后在4个子囊中表现为染色体基因的22分配规律,故称为分离性小菌落。第二类突变株在与野生型杂交时全部产生野生型子囊孢子,突变型与野生型的比例为04,称为中性或营养性小菌落。第三类突变株与野生型杂交后立即接种到产子囊培养基上则全部为突变型子囊孢子,但若让合子生长一段时间后再接种到产子囊培养基上则全部产生野生型子囊孢子。 

考虑到第三类突变株的细胞质中的遗传物质对野生型菌株起显性或抑制作用,故将其称为抑制性小菌落。研究表明,酿酒酵母的中性和抑制性小菌落突变均源于线粒体基因突变导致的代谢活力下降,当它们与野生型菌株杂交时,由于野生型配子细胞质中含有功能正常的线粒体而恢复成野生型。酵母的中性小菌落突变已完全丢失了线粒体DNA,抑制性小菌落突变只丢失了部分线粒体DNA而影响了线粒体的呼吸功能。 

二、酵母线粒体基因组的物理图谱及其特点

通过突变株之间的杂交和缺失定位等方法,已经绘出了酵母线粒体基因图(图77)。酵母线粒体DNA是周长约26μm的环状DNA分子,其大小为84kb。线粒体DNA编码蛋白质(细胞色素b、细胞色素c氧化酶、ATP酶等)、16tRNA基因和2rRNA基因。还有抗性基因:氯霉素抗性基因(cam)、红霉素抗性基因(ery)、寡霉素抗性基因(oli)等。

在线粒体DNA的组成方面,绝大多数的mtDNA中没有重复核苷酸序列,这是mtDNA一级结构的重要特点。线粒体是半自主性的,它们所含有的DNA不仅能复制并传递给后代,而且还能转录所编码的遗传信息,合成线粒体某些自身特有的多肽。线粒体遗传装置由线粒体DNAtRNArRNA、核糖体以及有关的酶组成,能够单独进行复制、转录和蛋白质合成,甚至基因重组。这表明线粒体确有自主性。 

尽管如此,线粒体的遗传装置并不是自给自足的,线粒体除自身的少数成分外,大部分蛋白质是由核基因编码并在细胞质内的核糖体上合成的。这两种蛋白质合成机制中最为明显的区别是对某些抑制物的不同反应效应,如线粒体蛋白质合成受到红霉素、氯霉素等一类抗生素的抑制,而真核生物细胞质中的蛋白质合成却是受放线菌酮(cycloheximide)的影响。

 

7. 丝状真菌中的转座因子

一、丝状真菌中的转座现象

含有转座因子的这些真菌大多是植物病原真菌、工业真菌或直接从田间分离的真菌,实验室内保存的菌株很少有转座因子;另外这些含有转座因子的真菌的遗传变异较大,一般都不能进行有性生殖。表 10-4是几种真菌  及其它们的转座因子。

真菌转座因子的鉴定,一般是通过下面四种方法。①克隆真菌中的重复序列,然后通过与其他生物中的已知转座因子进行比较来确定。②根据真菌的缺陷型表型来鉴定转座因子,这是一种最可靠的方法。如尖孢镰刀菌的一个转座因子就是在硝酸还原酶突变体中鉴定出来的,该突变体就是由于转座因子的插入而引起突变的。③通过同源杂交,即以别的生物中的转座因子为探针进行杂交筛选。④通过DNA序列进行分析。

二、丝状真菌中的转座因子的类型

根据转座机理,可将丝状真菌的转座因子分为两大类:第一类是类似反转录病毒的反转座子,其转座过程是以RNA为中间体,即从DNARNADNA的转座;第二类是类似于细菌转座因子的DNA转座子,其转座过程是从DNADNA。图10-21是丝状真菌转座因子的结构图和所发现的转座子种类。 

1、反转座子

反转座子的特征是在转座过程中,需要经过一个RNA阶段,即在转座过程中在RNA聚合酶的作用下先合成RNA,接着在反转录酶的作用下合成双链DNA,然后再将DNA插入到靶位上。根据反转座子的两端是否具有类似反转录病毒原病毒的长末端重复序列LTR而分为两种类型:LTR-反转座子(LTRretrotransposon)和非LTR-反转座子(non  LTR-retrotransposon)。

1LTR-反转座子 

LTR-反转座子的结构类似于反转录病毒原病毒,与反转录病毒原病毒的主要区别是反转座子不具有侵染性和不带有病毒外膜基因(env)。 LTR-反转座子具有长的末端正向重复序列(LTR),中央含有13个大的阅读框架:gag编码核酸结合蛋白;pol编码蛋白酶(PR)、整合酶(IN)、反转录酶(RT)及 RNase HRH)。

丝状真菌中的很多转座因子都属于这个类群。这类转座子还包括:酵母的Ty、果蝇中的copiagypsy、啮齿动物的IAPVL30、人类的THE、玉米的BSI等。

2)非LTR-反转座子  

这类反转座子在结构上与反转录病毒有很大的不同,它们没有长末端重复序列,但大多数在3末端具有富含腺嘌呤(A)的序列。在转座时,使靶位点产生721bp正向重复。哺乳动物的LINESINE是这一类反转座子中最先发现而且是研究最为深入的两个类型。 

a、LINE:这是一类拷贝数很多、序列很长的反转座子叫做长散布重复序列long interspersed repeated sequence, LINE。这类反转座子最先发现于动物基因组中。哺乳动物基因组包含2万~5万个LINE序列,简称L1.L167kb3末端有富含A的序列,含有两个各长1137kb3900kb的开放阅读框架(ORF),这两个ORF之间有14kb的重叠。第一个ORF的功能还不清楚,第二个ORF编码反转录酶(RT)(图10-22)。L1在靶位点具有正向重复序列。

bSINE:这类反转座子也是最先在哺乳动物中发现,后来在真菌中也发现这类反转座子。SINE一般都比较短,大约70300bp,但是拷贝数极高,通常在哺乳动物中的拷贝数达10万以上,丝状真菌中的拷贝数从几十到几百。这些反转座子称为短散布重复序列(short Interspersed repeated sequenceSINE)。SINE的特征是:具有 RNA聚合酶启动子,3末端有850bp多聚A尾巴,两端具有721bp正向重复序列,中间没有ORF,转座时需要经过反转座过程。

人类的Alu家族可以作为SINE的代表。 丝状真菌中也有很多这种SINE类型的反转座子,如 MGSR1 Mg-SINE(稻瘟病菌)、Eg-RIEGH(小麦白粉菌)等。 

总之,与真核生物的反转座子一样,丝状真菌的反转座子分为LTR-反转座子和非LTR-反转座子两大类型,而每一类型的反转座子又可分为不同的组。表10-5列出了一些真菌反转座子的特征如大小、拷贝数和寄主来源等。 

2DNA转座子

这是真核生物中的第二类转座子,它们通过DNARNA方式转座。它们的结构特征与细菌转座子类似,转座子的两端具有反向重复序列,中间有编码转座酶的开放阅读框架,在寄主的靶位点有正向重复序列,其转座机制不太清楚,它们可能是通过复制性转座机制进行转座。很多丝状真菌的转座子、果蝇的P因子、玉米的Ac/DsSpm/En因子、金鱼草(Antirrbinrm majus)中的Tam 属于这一类型。

10-6列出了几种丝状真菌转座子的特征。从表中可以看出,尖孢镰刀菌中类似细菌的转座子有:Fot1Fot2ImpalaHop,它们的特征与细菌转座子类似,在转座子的两端是长度为2796bp的反向重复序列,中间有一个编码转座酶的开放阅读框架,在寄主的靶位点有27bp的正向重复序列,这四个转座子的大小依次为1928bp2100bp3500bp1280bp

Fot1Fot2ImpalaHop这四个转座子都是通过对野生型菌株和硝酸还原酶缺陷型突变菌株中的硝酸还原酶基因(nia)进行比较而鉴定出来的。将烟曲霉(A.nidulans)的硝酸还原酶基因(niaD)转移到尖孢镰刀菌硝酸还原酶缺陷型中则可恢复其硝酸还原酶的功能。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

第五章 微生物药物产生菌的菌种选育

1.微生物药物产生菌的遗传、变异与育种

(一)微生物药物产生菌育种的理论基础 

理论基础:微生物学、微生物遗传学和生物化学等;

研究对象:微生物的遗传与变异

研究目的:微生物代谢产物的高产优质和开发新品种,不断为生产提供优良菌种,从而促进生产发展;

研究内容:主要为基因突变和重组,以及突变型和重组菌株的识别与筛选

(二)微生物药物产生菌菌种选育的重要性

从自然界筛选得来的菌株,药物代谢合成能力均很低。野生型菌株由于长时间生长在非最适条件下,大多只产生不到 l0 mgL产物;即使是已用于工业生产的菌株,为了不断提高产量、降低成本,菌种选育也是重要的手段之一。 

改变菌种的某些遗传性状,使之更适合于工业生产。 

 

2. 自然选育

()、自发突变机制

互变异构效应(1-3-1)4种碱基的第6位上的酮基和氨基,胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)可以以酮式或烯醇式出现,胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)可以以氨基式或亚氨基式出现。

平衡一般倾向于酮式和氨基式。 

自发突变的发生是偶然的,在任何时间、任何一个基因都可能发生突变,可是在什么时候什么基因将发生突变却无法预测 

(二)自然选育的内容

自然选育也称自然分离。自然选育的主要作用是对菌种加以纯化,以获得遗传背景较为均一的细胞群体。

一般菌种经过多次传代或长期保存后,由于自发突变或异核体和多倍体的分离,使有些细胞的遗传性状发生了改变,造成菌种的不纯,导致生产能力下降,亦即菌种退化 

因此,经常把自然选育和诱变育种交替使用,这样可以收到良好的效果。

 

3. 诱变育种

诱变育种在工业微生物育种中应用最早,当前,发酵工业中使用的高产菌株,几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株,故诱变育种至今仍是菌种改良的主要方法之一。
(一)诱变剂及其作用原理
诱变剂的种类很多,归纳起来可分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三大类。

1. 物理诱变剂

常用的物理诱变剂有电离辐射(如快中子、X射线、γ射线、微波、激光等)非电离

辐射如紫外线(UV)、长波紫外线(NUV)加光敏物质氧化补骨脂素(8-methoxypsoralen)、离子注入法等)

紫外线:紫外线使用时间较久,辐射光源便宜,危险性小,诱变效果好,故应用最广泛,研究得也最多。使用紫外线诱变,波长在260nm左右(253~265nm)诱变效果最好。

紫外线对DNA的作用方式主要是使DNA分子上相邻的胸腺嘧啶成为二聚体(1—3-3)

胸腺嘧啶二聚体的形成可以造成DNA分子构形扭曲,从而影响正常的复制和转录,以致菌体死亡。也可能使DNA复制过程中,正常的碱基无法配对,造成错义或缺失,从而诱发突变。采用紫外线诱变处理时,必须在暗处或红光下操作。

DNAUV照射形成胸腺嘧啶二聚体可通过切补修复(excisionrepair)(1—3—4)消除DNA结构的改变而使之恢复正常。 

常用咖啡碱协同处理,可强化UV的诱变作用,增加诱变率。

快中子、X射线、γ射线和β射线:电离辐射对生物的作用有直接作用和间接作用两种方式。直接作用是物理作用,指染色体吸收辐射能量后发生畸变;间接作用是化学作用,指辐射作用于染色体周围的水分子,这些水分子经射解作用产生了各种活性基,如·H·OHHO2·自由基以及H2O2等,然后这些自由基团与细胞中的溶质分子发生化学变化,造成DNA损伤 而引起突变(如嘌呤的失落和DNA的断裂)

快中子在诱变中有较好的效果,近年来国内已得到广泛应用。

微波近年来有人用微波诱变菌种,并筛选得到高产菌株。

微波是一种电磁波,能引起水、蛋白质、脂肪、碳水化合物等极性分子转动

尤其是水分子在2450 MHz微波作用下,能在1s180来回转动245亿多次,从而引起分子间强烈的摩擦,最终引起DNA分子结构变化,导致遗传变异。

微波具有极强的穿透效应,从而引起细胞壁通透性发生变化,更易使胞内代谢物分泌出来。微波引起强烈热运动所产生的瞬时热效应,容易引起酶失活,从而引起细胞的生理、生化变异

2. 化学诱变剂

化学诱变剂种类繁多,广泛使用的有烷化剂、嵌合剂、碱基类似物和抗生素等,每一种都以不同方式作用于DNA

烷化剂(Alkylating agent)烷化后的分子稳定性极低,很容易再发生变异。甲基烷化剂和乙基烷化剂对染色体的毒性不同,乙基烷化剂毒性较低,使用剂量较大,而收到的效果却较好。

在诱变育种中,人们使用最广的是亚硝基胍(NTG)和乙基磺酸乙酯(EMS),主要由于它们杀死率相对较低,而获得的突变频率较高。

NTG是一种诱变作用特别强的诱变剂,许多人称它为超诱变剂 

嵌合剂:常用的嵌合剂有吖啶类染料、溴化乙锭和ICR化合物。这类化合物的主要作用是能引起移码突变 

吖啶类染料能嵌入DNA分子中间,形成碱基的插入(insertion)或缺失而引起读框的错误,是有效的移码突变诱发剂。

一系列烷化剂和吖啶类相结合的化合物称为ICR化合物(它是美国一个癌症研究所的简称),也都是有效的移码突变诱变剂。能够嵌入DNA分子的物质还有溴化乙锭等。

碱基类似物:分子结构与DNA上的碱基相似的化合物称为碱基类似物。如5—溴尿嘧啶(5—BU)6—氨基嘌呤等。这些化合物干扰了DNA分子丙酮式与烯醇式的平衡。它们搀/DNA分子,使其出现烯醇的比例增大。

亚硝酸:失的有效诱变剂。

它的诱变作用主要是通过氧化脱氨基作用脱去 DNA 碱基上的氨基,从而引起碱基对的转换而造成突变。 

抗生素:丝裂霉素C ( Mitomycin C )、放线菌素 D ( Actinomycin D )等抗癌抗生素作用于 DNA 的合成,从而干扰细胞分裂正常进行。

丝裂霉素 C  DNA 结合时,大部分只和其中的一条链结合,一部分形成交联而阻碍了 DNA 双链的拆开,同时也引起单链断裂。 

3. 生物诱变剂 

噬菌体细菌或放线菌等微生物感染了噬菌体以后,常常必须筛选抗噬菌体的突变株,否则生产无法进行。其抗性突变株的抗生素产量会明显提高。特别是溶源性噬菌体是一种遗传信息的传递者,因而人们把噬菌体看做是一种诱变剂。

在选育放线菌抗噬菌体菌种(如链霉素、红霉素、万古霉素、四环素、卡那霉素、利福霉素、竹桃霉素等抗生素的抗噬菌体菌种)时,噬菌体显示出明显的诱变效应。

转座因子转座因子是一类能够转移位置的遗传因子,例如大肠杆菌的温和噬菌体 Mu -1 、各种转座子 Tn ( transposon Tn )和各种插入顺序( insertion sequence 15 )。

当转座因子转移到一个基因中时,便使这一基因成为一个突变基因(称为插人突变)。

 IS 不带有使细菌表现任何性状的基因; Tn 常带有抗药性基因,所以当 Tn 插人某一基因时,一方面使这一基因发生突变,另一方面在这一座位上出现了一个抗药性基因。

Mu 噬菌体的插人,则除了使细菌成为某一突变型以外,还使它成为一个溶源性细菌。

转座因子除了能引起插入突变以外,还能带来种种插入位置邻近的染色体畸变。

实验室可以利用已知的转座因子来取得插入突变,因此可以把转座因子看做是一种诱变剂。

()诱变剂的选择及影响诱变效果的因素

1. 诱变剂的选择

诱变剂的作用有:  提高突变频率;  扩大产量变异的幅度  使产量变异朝突变或突变的方向移动。

长期用于工业生产经过多次诱变选育的菌株,则宜用中等剂量(致死率为70%一80),甚至更低。他们认为低剂量处理能提高正突变率。 

2.影响诱变效果的因素

1) 选择合适的出发菌株

用作诱变的出发菌株必须产量高,对诱变剂的敏感性大,变异幅度大

2)采用分散状态的孢子悬浮液处理

诱变剂所处理的微生物一般要求呈悬浮液状态,并使细胞尽量处于分散状态。这样有利于细胞均匀地接触诱变剂,也可以部分地避免出现不纯的菌落。 

3)采用单核细胞(或核质体)处理

诱变剂所处理的细胞中的细胞核(或核质体)愈少愈好,最好是处理单核细胞。

假如所处理的是霉菌和放线菌等丝状菌,则应尽量采用孢子进行处理。

以避免出现不纯菌落,并且实验数据重复率较高。  

4)注意微生物的生理状态

微生物的生理状态对于诱变的效果也有影响。一般对数期的细菌对诱变剂的反应最为灵敏。

霉菌和放线菌成熟的分生孢子都处于休眠状态。但是如果使孢子稍稍萌发,则可以提高诱变效果。

5)适宜的诱变剂量 

()突变菌株的筛选

1. 高产突变株的筛选

一般测定一个菌株的产量高低以采用摇瓶培养居多,然后测定发酵液中代谢产物的量。 

在诱变育种工作中应该尽量利用菌落的可以鉴别的特性进行一次预筛选,把预筛选得的菌株再用摇瓶方法测定,这样就可以提高工作效率。 

为了提高高产突变株筛选工作效率,许多生产单位已推行筛选各步骤的自动化与摇瓶小型化,也可以采用琼脂块法进行预筛选(图 1 -3 -8 )。 

2. 形态突变株的筛选

利用形态突变株进行筛选是诱变育种有效的经典方法之一,在青霉素、环己酰亚胺、制霉菌素、四环素选种工作中均取得了好的效果。

有些菌种形态变异与产量变异有一定的相关性。但在很多抗生素产生菌中,形态剧烈变化的突变株多数是低产量突变,而伴随正变株发生的却是细微突变 

3. 自身耐药性突变株的筛选

实验证明,抗生素产生菌对自身抗生素的抗性基因往往与该抗生素生物合成基因连锁。

同活性的菌株,其对自身药物的耐受性不同,产生菌产量越低,对自身抗生素越敏感,产量越高抗性程度越强。

因此,可利用产生菌对自身抗生素抗性的提高来选育高产菌株。

抗生素的作用机制

作用于细胞壁:如青霉素和头孢菌素的抑制转肽酶反应和D—丙氨酸羧肽酶反应;

②作用于细胞质膜:如青霉素和头孢菌素除作用于细胞壁外,还能作用于细胞质膜的类脂中间体或酶,使细胞质膜受损伤,造成细胞内物质向外泄漏;

③作用于蛋白质:如某些氨基环醇类、大环内酯类抗生素能抑制蛋白质的合成;

④作用于DNA合成:如丝裂霉素C和放线菌素D等抗癌抗生素能抑制DNA的合成。

4. 营养缺陷型及其回复突变株的筛选

营养缺陷型菌株在科学研究和生产实践中都有十分重要的意义。

科学实验中它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导和原生质体融合等遗传规律所不可缺少的标记菌株,在生产实践中可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株。 

筛选营养缺陷型菌株三个步骤

 1)淘汰野生型

常常通过青霉素法、菌丝过滤法等方法如把诱变处理后的菌体培养在含有青霉素的基本培养基中,野生型被青霉素杀死而缺陷型仍存活,从而达到浓缩缺陷型细胞的目的。

菌丝过滤法适用于淘汰丝状菌的野生型。

2)检出缺陷型

(1)夹层培养法(1ayer plating method)  在培养皿中倒一薄层不含菌的基本培养基,待冷凝后加上一层含诱变处理后菌液的基本培养基,再在上边浇一薄层不含菌的基本培养基,经培养后,在皿底用笔对首次出现的菌落一一作好记号,然后再在其上倒一薄层完全培养基,再经培养后所出现的菌落,多数是营养缺陷型。

(2)影印接种法  将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面,经培养后长出菌落。然后用丝绒布将此皿上的全部菌落转移到基本培养基平板上,经培养后,比较这两个平皿上的菌落,如果发现在完全培养基上能生长的菌落,而在基本培养基相应的位置上却没有长出菌落,这一菌落可能就是一个营养缺陷型菌落。

3)鉴定缺陷型

把生长在完全培养液里的营养缺陷型菌体或斜面孢子洗下,用无菌水离心清洗,配成浓为108107个/ml的悬液,取01ml基本培养基均匀混合倒在培养皿上,待表面稍干燥后,在皿背划若干区域,然后在其上加微量氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物,经培养后,某一营养物周围有微生物生长圈者,说明该微生物就是它的相应营养缺陷型。

5. 结构类似物或前体类似物耐药菌株的筛选

当在青霉素产生菌产黄青霉菌的发酵培养基中加人苯乙酸或苯氧乙酸时,即能分别合成青霉素G和青霉素V。但培养基中过量的前体或前体类似物往往对产生菌的生长产生抑制作用,且可抑制代谢终产物的生物合成。

选育对毒性前体或其类似物的抗性突变菌株,就可以消除它们对产生菌的生长及其终产物生物合成的抑制作用或反馈调节作用。 

 

4. 杂交育种

杂交育种是将两个基因型不同的亲株的某些遗传信息,通过杂交重新组合于同一个重组体中,形成新的遗传型个体的过程。

传统的杂交育种在真核微生物中可以通过有性杂交及准性杂交两种途径;20世纪70年代发展起来的原生质体融合杂交育种技术则有更大的实用意义,我国育种工作者也已普遍推广使用此种方法。

(一)有性杂交( sexual hybhdization )

有性杂交,一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组,进而产生新遗传型后代的一种育种技术。

凡能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和覃菌,原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。

把不同生产性状的甲、乙两个亲本菌株(双倍体)分别接种到含醋酸钠或其他产孢子培养基斜面上,使其产生子囊,经过减数分裂后,在每一子囊内会形成 4 个子囊孢子(单倍体)。

用蒸馏水洗下子囊,用机械法(加硅藻土和石蜡油后在匀浆管中研磨)或酶法(用蜗牛消化醉等处理)破坏子囊,再行离心,然后把获得的子囊孢子涂布平板,就可以得到由单倍体细胞组成的菌落。

Aspergillus  nidulans构巢曲霉 

由于其自发的单倍化频率很低,故常在培养基中加对氟苯丙氨酸(pfluorophenylalanine),因为该物质能促进体细胞重组,提高分离子出现频率,故能诱导提高单倍体化的频率 

在生产实践中,通过杂交育种成功地获得了青霉素产生菌产黄青霉的高产重组体菌株,提高了青霉素的发酵单位。

此外灰黄霉素产生菌的杂交育种也获得了成功,得到了高产菌株。

(二)原生质体融合杂交

原生质体融合育种的基因重组频率高于普通杂交方法,目前报道的以种间融合研究较多,而属间、甚至门间也实现了原生质体融合,这就为亲缘关系较远的、性能差异较大的菌株实现杂交开辟了一条有效途径。 

1. 原生质体融合的步骤
1) 选出标记菌株

 供原生质体融合用的两个亲株要求性能稳定并带有选择标记,所用标记大多采用营养缺陷型或抗药性标记,也有采用温度敏感型、糖发酵和同化性能、呼吸缺陷和形态、色素标记等。

2) 两亲株分别制备原生质体

一般细菌和放线菌多采用溶菌酶;酵母菌可用蜗牛酶或纤维素酶(cellulase)霉菌用蜗牛酶,也有用几丁质酶(clutinase)和壳聚糖水解酶、纤维素酶等。

3) 亲株原生质体进行融合

两种亲本菌株的原生质体等量混合,加入聚乙二醇(PEG)助融。

一般原生质体融合多用相对分子质量为1 000-6 000范围的PEG。融合同时还加入二价阳离子Ca2+Mg2+

使用PEG的最终质量分数为50%,在40%或60时,融合频率稍微下降(以重组子形成为依据)MgCl220mmolL左右,CaCl250mmolL左右。

此外还可进行电融合-----交流电场法

交流电场法是将两根平行的电极置于原生质体悬浮液中,由于双向电泳的作用,使两根电极之间的原生质体在非均匀交流电场中沿着电力线排列成串,然后施加高压直流脉冲使原生质体融合。

与一般PEG介导的融合相比,电融合,特别是交流电场法电融合的融合频率比较高,操作简便,而且还可以避免PEG对细胞的毒害作用。

电融合在细菌和动植物细胞中应用较多,在放线菌中报道较少。

4)原生质体的再生原生质体已经失去细胞壁,仅有一层厚约l0 nm的细胞膜。它具有生物活性,但在普通培养基上不能生长,必须涂布在再生培养基上。再生培养基的必要条件是高渗透压

一般加0.3molL以上的蔗糖,否则原生质体容易破裂。

在合适的再生培养基上,原生质体可再生出细胞壁成为完整的细胞,并恢复其分裂繁殖的能力。

在再生培养基上长出的菌落,可以移至普通培养基上生长。

5) 融合子的选择

融合子的选择主要依靠在选择培养基上的遗传标记,两个遗传标记能互补,就可确定为融合子。

原生质体融合的特点

1)重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交

2)可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体

3)被灭活的原生质体进行融合后仍可能获得重组体

4)原生质体的形成与再生本身可能就是一种育种方法

(三)接合杂交

在细菌和放线菌中,接合(conjugation)是最常见的杂交方式。

两个亲株的细胞在固体培养基上混合培养时,一个亲株细胞的基因组片段进入另一个亲株的细胞,发生部分染色体的转移或遗传信息的交换,形成部分合子(merozygote),经过两次交换形成单倍重组体 

接合杂交在工业微生物的菌种改良中也有一些成功的报道,但多数效果并不明显。 

 

5. 分子育种

20世纪80年代以来,对链霉菌特别是抗生素产生菌分子遗传学的研究取得了较大的进展,已对多种抗生素的生物合成基因进行了不同程度的研究。

此外,对微生物次级代谢产物的生物合成及调控机制的研究也取得了不少重大进展。

分子育种在工业上已经取得了有重要实用意义的成果,引起了人们广泛的重视,目前主要发展包括以下几个方面。

(一)提高微生物药物的单位产量

1. 增加限速酶基因拷贝数,提高菌种生产能力

限速酶成为生物合成途径中的“瓶颈”,限制了终产物的产量。增加该酶基因的剂量,即可能解除或缓解此“瓶颈”效应。

2. 引入抗性基因和调节基因,增加微生物药物单位产量

许多抗生素生物合成基因往往与菌种对自身抗生素耐药基因连锁存在,因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,提高菌种对自身抗生素的抗性,增加与抗生素生物合成有关的自身抗性基因的剂量

调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要的作用,增加正调节基因的拷贝数也能大幅度地提高次级代谢产物的合成能力。 

(二)阻断支路代谢,增加有效组分的含量

日本和美国科学家对阿弗米丁生物合成途径及其产生菌的分子生物学特性进行了深入的研究,获得了一系列阻断突变株及其相关的生物合成酶基因,并绘制了基因图谱。

他们应用基因工程技术,构建了基因工程菌。将来自新霉素产生菌弗氏链霉菌的衍

转座子Tn4560整合到野生型菌株上,获得不产寡霉素的重组子。 

(三)构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌

许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化学修饰获得的。例如半合成头孢菌素的中间体是头孢菌素C的衍生物7-氨基头孢烯酸(7-ACA),或青霉素G和青霉素V的衍生物7-氨基去乙酰氧基头孢烯酸(7-ADOCA),但这些中间体的制备工艺均较为复杂。

Isogai等曾分别将茄病镰刀霉(Fusairium solani)CPC酰胺裂解酶(CA)基因和来自缺陷假单孢(Pseudomonas  diminuta)D—氨基酸氧化酶(DAO)基因导人顶头孢霉,可将头孢菌素C生物合成途径中去乙酰氧基头孢菌素C转化为7-ADOCA,和将去乙酰基头孢菌素C转化为7-氨基去乙酰基头孢烯酸(7-ADACA),同时还能将头孢菌素C转化为7-ACA

(四)构建产生新化合物的基因工程菌

许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强,当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中时,可使其产生不同于两个亲株产物的具有生物活性的新化合物杂合抗生素(hybridantibiotics) 

(五)引入血红蛋白基因,改善微生物的工业性状

20世纪70年代末在专性好氧菌透明颤菌(vitreoscilla)中发现了血红蛋白(VHb)

研究表明,它是一个氧气携带者,能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上,使该细胞在贫氧状态下也能很好地生长。

1988年,KhoslaDikishit分别从Vitreoscilla菌染色体中分离出血红蛋白基因(Vgb)

Maynolo等将Vgb基因通过piJ699质粒转入变青链霉菌(S1ividans)和天蓝色链霉菌(Scoelicolor)中,获得了发酵需氧量明显降低的工程菌。 

 

 

 

 

 

 

 

第六章  DNA重组及基因工程菌构建

1.基本概念

重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受 体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物 或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术。 因此,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。组DNA技术的三大基

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技 术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

2.基本原理

重组DNA技术与基因工程的基本用途:

分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源

大规模生产生物活性物质

设计、构建生物的新性状甚至新物种。

基因工程的基本形式:

第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程

第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程

第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程

第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程

3.重组DNA技术所需的基本条件

用于核酸操作的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA连接酶

DNA聚合酶

核酸酶

核酸修饰酶

4 重组DNA技术的操作过程

切、接、转、增、检

 

第七章  微生物发酵与发酵工程

1. 微生物发酵

发酵(fermentation)

没有空气的生活(life without air---- 巴斯德

细胞在厌氧条件下代谢营养物获得能量的生化反应

微生物生长并进行生物转化的过程

发酵的目的:获得生物量 获得目的产物

发酵的基本流程:? 斜面(试管、茄子瓶)? 摇瓶(1~2级) ? 种子发酵(1级或多级) ? 主发酵 ? 后处理

无菌操作

接种间

辐射灭菌

化学灭菌

空气过滤

发酵罐

高压蒸汽灭菌

通气系统

过滤灭菌T°C

发酵温度

连续灭菌

间歇灭菌

发酵过程的噬菌体问题

现象:发酵不正常,产量、糖耗、pH、粘度、泡沫等

镜检:溶菌现象

防治:定期检查设备、管道管件、过滤器等环境

药物:鳌合剂、抗生素

菌株:抗性菌株、菌株轮换

发酵过程的主要控制参数:温度 pH 营养 溶氧 通气量 搅拌速度 压力

发酵类型:

I:  产物是初级能量代谢的结果,一般是糖的直接氧化产物。

A ¨ P        or      A ¨ B ¨ C ¨ P

例:乙醇发酵、乳酸发酵

II: 产物通过能量代谢的间接途径得到。

                 A ¨ B ¨ C

                        $     $                   

                        D     E

                           $    

                           P

例:柠檬酸发酵、氨基酸发酵

III:产物不是初级代谢形成的,与微生物细胞的物质代谢无关。

例:抗生素发酵

发酵方式:批式(batch)发酵、补料流加(fed batch)发酵、连续(continous)发酵

批式发酵的产物形成:

生长结合型 (growth associated):产物形成与生长的限制因子相同

非生长结合型 (growth unassociated) 产物形成速度取决于微生物浓度

产物形成速度由与比生长速度无关的其它因素决定,不能用动力学方程描述,但可对具体的发酵过程简化一些条件后建立数学方程。

产乳酸发酵:发酵的后处理

后处理在发酵工业中的地位:

普通发酵产品,后处理成本 > 60%

基因工程发酵产品,后处理成本 > 80%

后处理的一般流程:

发酵液 ¨ 分离细胞 ¨ 浓缩 ¨ 粗分离 ¨ 精分离 ¨ 制成品

后处理工艺的设计原则:

产品的性质

产品的要求经济 环保 稳定

细胞的分离与破碎:

细胞的分离

过滤(压滤、抽滤、膜分离)

沉降(重力、离心)

絮凝

细胞的破碎

物理(超声、机械)

化学

生物

膜分离

微滤( 0.1m - 10 m

超滤(MW1000 - 100000

固态发酵

固态发酵:微生物在没有或很少游离水的潮湿固体培养基上生长与代谢的过程

特点:投资少、能耗低、原料廉价、传热传质差、效率低

应用:生物农药、饲料、粗酶、食品等

发酵条件的优化

确定优化目标

                    T

            S                    P + B + s

产率:            P                  ( g/L )

转化率:        P/(S s )     ( %,  g/g )

生产强度:    P/T              ( g/L.h )

其他

确定影响因素

种子:种龄、接种量 ?

培养基:组分、pH、灭菌条件?

环境:温度、pH、通气、搅拌、压力、设备?

2.发酵工程概述

(一)发酵工程技术发展及其意义

发酵?

生理学角度:微生物的无氧呼吸和有氧呼吸以外的一种生物氧化作用──有机化合物既是电子(或氢)供体又是电子(或氢)受体。

工业生产角度:利微生物的机能进行物料加工以获得工业产品生产或为社会服务(环境保护)的过程,又称微生物工程。

发酵工程的历史过程

发酵工业的第一个转折点:非食品工业

发酵工业的第二个转折点:青霉素→抗菌素发酵工业

发酵工业的第三个转折点:切断支路代谢转折点:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏)→,解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用突变株的应用,前体、终产物、副产物等

发酵工业的近代转折点:基因、动物、海洋

发酵现象的早期认识:

1680年制成显微镜 ─── 微生物的存在

1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的

1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 ───  

发酵工程的早期阶段:

人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末,主要来自于厌氧发酵,如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。

20世纪初期,1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇,德国采用亚硫酸盐法生产甘油(第一次世界大战)──由食品工业向非食品工业发展

好氧发酵技术:速酿法从乙醇生产醋酸,通气法大量繁殖酵母,用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖,用微小毛霉生产干酪。

1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀,增殖时间短。

发酵工程的重大转折点:

二十世纪四十年代初,第二次世界大战爆发,青霉素的发现,迅速形成工业大规摸生产。

1928年由 Fleming发现青霉素 

1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究

表面培养:1升扁瓶或锥形瓶,内装200mL麦麸培养基  ───  40u/ml

1943年沉浸培养:  5m3  ───  200u/ml

当今: 100m3200m3  ───  5-7u/ml

链霉素、金霉素、新霉索、红霉素

主要的技术进展:

通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。

抗杂菌污染的纯种培养技术:无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。

意义:

抗生素工业的发展,建立了一套完整的好氧发酵技术,大型搅拌发酵罐培养方法,推动了整个发酵工业的深入发展,为现代发酵工程奠定了基础

学科发展与属性:

微生物利用工业的迅速发展──产生了生化工程学科

发酵工程的三大学科基础──微生物学、生物化学及生化工程

现代生物技术──分子生物学
发酵工程

20世纪50年代:

氨基酸发酵工业──谷氨酸、赖氨酸

核酸发酵工业──肌苷酸、乌苷酸

微生物变异株通过代谢调节──代谢控制发酵技术

切断支路代谢转折点:  酶的活力调控, 酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用,突变株的应用,前体、终产物、副产物等

20世纪70年代:

细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展,打破了生物种间障碍,能定向地制造出新的有用的微生物:增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数,可以大幅度地提高目标产物的产量;将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中,快速经济地大量生产这些产物;将具有不同性能的多种质粒植入,使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护人类基因组测序完成的后向功能基因组学转变 ──  功能基因及其表达产物的获得。

细胞大规模培养的优化技术对当前生物技术产业以及今后的潜在发展具有重要影响。

    ──  利用微生物进行产品生产

(二)发酵过程生产方式

发酵生产的基本类型:

固体发酵

液体发酵

基本操作模式:

沙土或冷冻保贮菌株→斜面菌种培养→菌体或孢子悬浮液制备→种子扩大培养→发酵→发酵液处理→提取与精制→制剂制造→成品检验与包装出厂

固体发酵将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物(载体)上,通过微生物代谢活动,使发酵原料转化为发酵产品

浅层发酵、转桶发酵和厚层通气发酵:

优点设备简单、方法简便、能耗低、原料粗放、不易污染、产物回收耗溶剂少,所生废水少。

缺点占地面积大、劳动强度大、传质传热困难、产率和收率低、副产物多、培养过程质量控制难、不适合一些复杂调控操作发酵

液体发酵生产:发酵原料制成液体培养基,表面发酵和深层发酵

深层发酵:菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基中,通气或不通气

优点占地面积少,生产规模大;

发酵速度快,生产效率高;

生产机械化,易于自动化控制,劳动生产率高;

发酵设备紧凑,传热传质良好,生产便于管理;

副产物少,有利于产品提取,产品质量高  

类型分批发酵,补料分批发酵,连续发酵

分批发酵:一次性投入有限数量营养物,灭菌后接种入所要培养的微生物,然后控制适宜的发酵罐条件(温度、通气、搅拌速度、pH等) ───非恒态培养,营养成分不断减少,微生物相应生长,产物不断形成

补料分批发酵:分批发酵中间歇地或连续地补加含有限制性营养物的培养基,到某一定时间产物才从罐内放出。

优点:通过调节在发酵罐中的营养物浓度,可避免代谢调节中的抑制、阻遏或毒性对生长的抑制;可避免一次投料过多,造成细胞大量生长,溶解不足,通气搅拌无法适应;营养缺陷型菌的营养物量的控制,高效率积累产物;挥发性物质的低浓度控制;

半连续(代放)发酵:在补料分批发酵基础上以一定的间隔时间从发酵罐中多次放出一定体积的发酵液,直到发酵终结才全部放出发酵液。

优点:具有补料分批发酵的优点;

控制比生长速率使菌体代谢酶体系处于最优;

提高发酵罐的生产能力(发酵指数);

适合于菌体生长较快的半关联生长的次级代谢产物;

适用于多罐发酵车间的代放安排集中分离提取。

连续培养:以一定速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时,将含有微生物和产场的培养液以相同速度从发酵罐内放出,发酵罐内液量维持恒定。

经过一定时问培养后,培养物就近似于恒定状态的生长和代谢,这时所有物质(营养物、产物、微生物细胞等)的浓度、环境的物理状态(如pHDO)以及比生长速率等始终维持不变,即稳定状态。

特点:

恒定的生理状态(比生长速率恒定),有利于微生 物生理特性和遗传特性的研究-动力学和最适培养条件的研究;

基质在发酵罐中停留时间短,原材料转化率低,只能适用在生长快的微生物菌体;

在长时间培养过程中菌种易变异,有可能产生适应特殊环境的负变异菌株,而且易于染菌。

发酵过程的重要环节:

菌种来源:生产菌的筛选、单菌和混合菌、筛选方案的设计、含微生物材料的选择与预处理、分离培养基、菌种的平板培养(不同温度和时间)、菌落的选择。

菌种选育:自然选育、诱变选育、杂交杂育、原生质体融合、基因工程改造、DNA突变技术。

培养基成分及来源:碳源、氮源、无机盐及微量元素、前体促进剂和抑制剂;斜面、摇瓶、种子、发酵。

纯种发酵与无菌技术:培养基灭菌、无菌空气、密闭设备与罐压、无污染接种

种子扩大培养:一级或多级种子制备、种子质量控制

发酵工艺控制:温度、通气量、搅拌、消泡沫、pHDO、培养基配比、菌丝形态、放罐时间、接种量、其他各种操作

发酵罐与计算机控制通气、搅拌、密闭、各种高级控制

辅助设备:

公用系统:空压房、冷冻设备、锅炉房、水系统、污水处理、发电厂

原材料仓库与配料间:

后提取车间与成品仓库:

菌种保存与种子制备实验室:

中间分析实验室:

发酵车间设计

工艺流程:菌种、种子培养、发酵、控制条件(温度、时间、)、技术水平

设备平衡:生产能力、经济指标、技术指标、设备平衡计算

车间设计:平面与立面布置、管路设针

厂区设计:风向、绿化、人流与物流、生活区与工厂区

人员岗位与运行管理设计:

基建及施工设计:

(三)发酵工程研究的主要现状和问题

提高产品的市场竞争能力,降低成本,提高产品质量:        

控制不同的操作条件时,有完全不同的产量和质量结果?? 优化

从小罐放大到生产罐,有很大差异,可能要失败 ?? 放大

菌种选育:

基因工程菌的构建

忽视了生物反应器中工程问题所必须加以考虑的工艺变化和过程优化。

采用人工经验为主的静态操作

另一方面,计算机技术的高度发展也在客观上为分析和优化控制这种复杂的发酵过程提供基础,因此,借助于计算机系统对发酵过程进行数据处理,分析和控制就愈来愈成为人们的迫切要求。

生理生化特性:

微生物生长和反应过程研究

微生物的生长反应特性是发酵过程优化的最重要的出发点。

基质进入细胞、胞内反应、代谢产物的胞内外分泌等全过程进行分析

胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的物质和能量的关系

发酵过程的化学计量学和热力学研究:

经过1000多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成分,一般把细胞看作一个开放的黑箱系统。

化学计量学主要研究有关发酵过程中反应组分组成变化的规律,把生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式来表示。

微生物反应动力学与生物反应工程:

微生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容,主要研究生物反应的速率及其影响因素

通过基质消耗、细胞生长和产物形成的数学描述,反映微生物系统的状态特征

提出了许多数学模型:经验模型、机理模型;统计模型和非统计模型;结构模型和非结构模型

实际发酵过程是在生物反应器中进行,这就是宏观动力学研究,逐渐发展成生物反应工程

测量参数及其变化的意义缺乏理解

最佳工艺控制点为依据的静态操作方法,只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的简单延伸,

缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容

发酵过程优化与放大仍是一个令人困惑的问题?

对于活体细胞调控来说,采用传统的生物学方法或化学工程的调控方法,存在很大的问题,国内外都没有很好解决。

三、发酵举例

制造微生物生物量

PHB发酵

黄原胶发酵

二元酸发酵

丙酮酸发酵

乙醇发酵

Vc发酵

制造微生物生物量

单细胞蛋白    假丝酵母(Candida sp.)

面包酵母   酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

微生物肥料  根瘤菌(Rizobium sp.)

微生物农药  苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)

三次采油  解烃棒杆菌(C.hydrocarboclastus)

环境治理  芽孢杆菌(Bacillus sp.)

卡介苗  无毒结核分枝菌(Mycobacterium tuberculosis)

黄原胶发酵

野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris产生的胞外多糖发酵液粘度可达7000cp

非牛顿型发酵

二元酸发酵

CH3(CH2)nCH3     

     ↓

     ↓              β-oxidation

CH3(CH2)nCOOH    →→    CH3(CH2)n-2COOH

     ↓

     ↓ ω-oxidation

HOOC(CH2)nCOOH

 

水、油、气、固多相反应

β-氧化与 ω-氧化

乙醇发酵

产物抑制问题

原料成本问题

Vc二步法发酵

 

              弱氧化醋杆菌               大、小菌混合

山梨醇                    山梨糖                        2-酮基-L-古龙酸

丙酮丁醇发酵

丙酮丁醇是良好的有机溶剂机合成工业的重要原料。

1861年巴斯德发现细菌能产生丁醇。1866年英国最早用丁二烯作为合成橡胶的原料.加速了丙酮丁醇工业的商品化生产。19081911年汽车工业需要橡胶,制造人造橡胶的丙酮丁醇需要量大增。1914Chain Weizmann分离到丙酮丁醇菌, 丙酮丁醇产量提高4倍,使该行业开始进入工业发酵生产阶段。

1916年在第一次世界大战期间,丙酮用于制造无烟火药,需量剧增,于是着手研究发酵法生产的改进,直到1930年完成生产工艺。发酵法生产丙酮丁醇一直是当时的主要方法。

1960年后,由于以石油为原料的化学合成丙酮丁醇更经济,美国和其它一些国家相继停止了发酵生产。我国现在是两种方法并用。

一、  丙酮丁醇的生产方法

()合成法  例如,用稀酒精催化制丙酮,用石油气中的丙烯制成异丙醇,再经氧化脱氢制丙酮;用丙烯与苯制成异丙苯,再氧化制丙酮及苯酚。丁醇的合成有乙醛缩合加氢、丙烯羧化加氢和乙醇直接合成丁醇等。(如下式)

()发酵法  和酒精发酵样,以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和野生植物等为原料,利用丙酮丁醇菌所分泌的酶来分解淀粉成糖类.再经过复杂的生物化学变化,生成丙酮、丁醇和乙醇等产物,同时还产生大量的CO2H2等副产品。

二、 淀粉质原料的丙酮丁醇发酵

丙酮丁醇菌在广义上属于丁酸菌族。丁酸菌是嫌气性的,有鞭毛,能运动的杆菌.在产生孢子时成为纺锤状或鼓槌状。细胞内含有淀粉拉,能被碘液染成深蓝色。

丙酮丁醇菌除具有丁酸菌的通性外,还具有能发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能力。

在中性培养基中发酵时,一般丁酸菌和丙酮菌均能产生丁酸和醛酸、当培养基的酸度增加到一定数值后,一般丁酸菌即停止发酵,并且菌体的繁殖也停止.但是丙醇丁醇菌则不然,当培养基的酸度达到最高点后,由于有脱羧能力,酸度反而下降,并且产生中性的产品-------丙酮、丁醇、乙醇等(31)

由于丙酮丁醇菌的上述持性,为区别于般丁酸菌,将能引起丙酮、丁醇发酵的细菌命名为丙酮丁醇菌。几种与丙酮丁醇茵类似的梭菌简述如表31

丙酮丁梭菌:能发酵玉米、马铃薯等淀粉质原料和蔗糖等糖质原料而产生溶剂,CO2H2和少量有机酸。溶剂的比例为:6份丁醇3份丙酮:1份乙醇,即BAE6:3:1,不同的变异株有不同的比例数。

发酵温度为35-36℃用玉米发酵时玉米浓度为5%一8%,用马铃薯时,发酵醪中鲜马铃薯量为20%,在4860 h就可以发酵结束。

三、种母的培养与制备

1.丙酮丁醇菌的分离与纯化方法

在土壤、细泥、粪便中及新鲜果实、蔬菜的表面上.均有丙酮丁醇菌存在。利用它的孢子的嫌气性和耐热性,可以采用热淘汰法和单细胞分离法.以获得优良的菌种。

由于丙酮、丁醇发酵时,易受杂菌侵染而导致酸败.所以,丙酮丁醇工厂须经常进行菌种的分离与纯化工作,以保证正常生产。

所谓热淘汰法,即将含有丙酮丁醇菌的试样接入5%的玉米醪试管内.再放在沸水浴中1-15min,杀死不耐热的杂菌和热抵抗力较差的孢子,而保留对热抵抗力较强的丙酮丁醇菌孢子,然后在爆气状态下培养。培养液产生大量气体,这时可转接到新鲜培养基试管内,同法进行热淘汰和嫌气培养,如此反复多次,即可获得较好的菌株。

欲获得纯培养或者需从发酵醪中选取优良菌株,可用嫌气平板进行单菌落分离。如用有明胶或碳酸钙的培养基,则可能出现溶解圈。然后接入玉米醪中测定气体产生量和丙酮产量。获得的优良菌种用沙土管保存。

2.种母瓶培养:将一支试管菌种接种到盛有5%浓度的玉米醪液的种母瓶中,在常压下培养24h,即可接入第一种母瓶。一船丙酮丁醇菌孢子萌发时,要求嫌气条件较高,营养体繁殖时,由于本身产生的H2CO2已能满足嫌气条件。

3.第一种母罐:其中盛有6%浓度的玉米醪接入种母瓶的醪液.培养1215h后,即可按入第二种母罐。

4.第二种母罐:其中盛有8%浓度的玉米酵,接入第一种母罐酵液,培养20 h左右,然后将总量l312送入发酵罐。

制备种醪的方法有间歇调制种醪法,半连续调制种酵法,利用部分发酵醪制种醪法。

四、发酵

()发酵醪制备  

目前国内都以8%玉米粉作发酵酵。原料经粉碎蒸煮即可。蒸煮发酵醪时常加入一定量的废醪(10-25%),这不仅增加部分营养,而且降低粘度。蒸煮过程也是灭菌

过程,因而蒸煮多以高温连续蒸煮为主(方法同酒精发酵).然后

冷却进入发酵罐,制备好的种醪也从种母罐同时流入发酵罐。

(二)发酵过程生化变化 

   发酵过程通常经过三个阶段,即前发酵期、主发酵期和后发酵期,整个发酵过程经4072h结束。

1.前发酵期:主要为种菌繁殖期。细胞数激增,酸度增加,所以又称为增酸期,由于丙酮丁醇菌细胞活动的结果,也产生少量的溶剂,主要的发酵产品为醛酸、丁酸、氢气、二氧化碳等。

此时淀粉的消耗量为30%左右,丙酮丁醇菌和其它细菌不同,它所需的诱发期很短,很快即可增殖,通常前发酵期为开始发酵后的1518h

2.主发酵期:丙酮丁醇菌已能旺盛发挥它的发酵特性,将前一阶段产生的醋酸、丁酸等变为丙酮、丁醇等溶剂的阶段.

在此阶段气体发生量达到最高蜂,溶剂生成很快,酸度下降至原有酸度的12左右,所以又称减酸期,此时期在1840 h后。

3.后发酵期:酸度达最低后,又稍为上升,维持定水平至发酵结束,所以又称酸度复升期。

此时所积聚的酸主要为不挥发酸,挥发酸量和溶剂也稍有增加,但是由于丙酮丁醇菌在此时期开始自溶,以及部分丙酮丁醇菌产生孢子.所以活动的丙酮丁醇菌逐渐减少,发酵逐渐衰弱以至结束。此时期在4070 h

()发酵的方法

有间歇发酵法(包括一次加料法、分次流加法)串联式发酵法相连续发酵法,目前多采用串联法和连续发酵法。

()影响发酵的主要因素

1.温度:最适发育温度为3637℃ 。正常生长时期最高温度为40 ℃左右,有试验表明,当发酵温度增高时.溶剂产量降低,残余糖量增加。

2.培养基的PH值:培养基中性时,丙酮丁醇菌具有使淀粉发酵成丁酸、醋酸等的能力,而使pH下降,而在酸性培养基中具有将醋酸、丁酸变为丙酮丁醇的能力,丙酮丁醇菌繁殖的最适pH值为5.57.0

3.培养基的氧化还原值:丙酮丁醇菌是嫌气菌。氧对它有毒害作用。嫌气条件不仅和氧有关,而且更和培养基的氧化还原值有关。

通常rH279能正常发酵,当rH2向氧化方面变动为102时.则不能进入第二阶段发酵;当rH2再大时,菌种不仅不能发育而且逐渐死亡。

PH低于4或高于8时,细菌的繁殖完全停止,不同的生长阶段有所不同,第一阶段pH值可以较高,如果开始pH过低,丙酮丁醇菌会生长不良,在发酵第二阶段,最适PH值下降为4353较适合。

丙酮丁醇菌因为发酵时能产生氢气、CO2,所以,只要开始发酵时能建立嫌气状态,以后则由于培养基继续为放出的氢和CO2所饱和,就能阻止空气中氧气入内,并且醪液是胶状物,培养基的粘度和固体颗粒对造成嫌气条件也有帮助。

4.醪液与发酵产物浓度:丙酮丁醇菌虽然能产生丙酮丁醇,但如果醪液中丙酮丁醇量过高时,对菌本身有毒害。所以.丙酮丁醇发酵时所采用的醪液浓度般为8%一10%。

在发酵醪内.溶剂的最高浓度只能达到25g/L(25)。其中包括丙酮0.85%.丁醇1.5%,乙醇0.15%。发酵醪中丁醇量如超过15%,对丙酮丁醇菌则有抑制作用.因此丙酮丁醇发酵时,醪液的浓度需要配合菌种能忍耐溶剂的浓度来决定。

其它如发酵时产生的糠醛,原料中的单宁等对发酵都有一定影响。

三、 如何提高溶剂产量为了增强发酵法的竞争力,提高溶剂产量是根本任务。

1.菌种选育。由于菌本身受溶剂的影响很大,特别是丁醇的浓度,在发酵液中一般达到1% 时,即为致命的水平(丙酮的毒性较低,一般菌能耐2.9%的浓度).因此,溶剂产量的高低往往与菌株对丁醇的耐力有关。

在丁醇的存在下,采用常规的诱变手段(如亚硝基胍),可以获得一定量的高产菌株。现发现耐丁醇的突变株与野生型菌株的细胞膜类脂成分有所不同。

当野生型菌株的生长进入稳定期时,不饱和脂肪酸的百分率与饱和脂肪酸百分率比值的增加是一致的,可是耐丁醇菌株,在同一时期在这比率上呈现出明显的变化,即不饱和脂肪酸的比例随时间延长而增加。

这表明,通过合成不饱和脂肪酸,耐丁醇的突变株可建立起一种补偿由丁醇引起膜流动效应的机制,它使得微生物维持在——种等粘度的膜状态。 

2.发酵过程中,加入乙酸和丁酸的作用。有一试验表明,在正常的培养基中,于接种后和培养24h后加入2g/L5g/L2g/L的乙酸和丁酸,其效果见表32

从表32中可以看出,接种后加入2g/L的乙酸,可增加丙酮的形成.总溶剂达234,并使糖的转化率从324%提高到341%。加入2gL丁酸,则增加总的溶剂量,糖转化率达351%。同时加入合适浓度的乙酸和丁酸,总溶剂达到24.7gL,丁醇与丙酮的比为2

3.消除培养液内还原性化合物,如用真空法、通氯法等消除氢气,有利于提高产量。

4.培养液适当的碳氮比是获得正常的溶剂产量的关键,高与低的比例均非适宜。

5.消除溶剂对菌的抑制作用,如加蓖麻油活性炭、多种聚合树脂等的吸附发酵;加入油醇等的萃取发酵;不断的移去产生的溶剂,不断的补加碳源。

7.固定化细胞的溶剂生产。例如,可以用海藻酸钙固定菌细胞或孢子.以N2维持嫌气和无菌。固定的营养细胞如果处于溶剂产生期,在整个延续期间,溶剂会连续产生。

固定化孢子可以避免细胞代谢活动的干扰。在胶体内的活性细胞充分生长后,能够恢复高生产能力,结果表明连续生产完全可能。固定化细胞的丁醇产率比常规的分批工艺要高得多。

 

 

第八章 微生物在生物技术中的重要作用

生物技术为高新技术

高新技术的成因

1.在基因工程中作为载体 (已述)

如:在基因治疗中作为基因转移的载体,如逆转录载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等。

 

2.在基因工程中作为表达系统

利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

美国Ely LiLi公司采用重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌工艺年产十几吨的重组人胰岛素。

酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征

利用重组酵母生产乙肝疫苗

酵母细胞生产乙肝疫苗

 

3.在发酵工程中作为发酵菌种,生产多种产品

今天的发酵工业已经发展成强大的工业体系,由于发酵工业的主要原料都是可再生的农副产品,完全符合绿色化学和可持续发展的原则,发酵产品已经应用于资源、能源、农业、人类健康及环境等各个领域,并将不断发展。传统发酵和酿造食品。

几千年来,人类就一直在经验地利用微生物生产面包、馒头、酒、醋、奶酪、腌菜等传统发酵和酿造食品。

利用微生物发酵生产的产品种类繁多,20 世纪末,初级代谢物的市场在 100 亿美元左右,主要是一些氨基酸、有机酸、维生素、酶制剂等工业原料和食品添加剂;次级代谢物的市场在 400 亿美元以上,主要是抗生素和其他各种药物。

有机酸  氨基酸

近年来有机酸发酵工业的发展速度也非常快,其中规模最大的是柠檬酸发酵。20 世纪末世界柠檬酸年产量已经超过 100 万吨,单是我国丰原生化一家企业的年产量就超过了 20 万吨。

葡萄糖酸可以用作饮料和食品的酸味剂,葡萄糖酸钙常用于补钙剂,…….是由葡萄糖经微生物催化氧化生产的。

苹果酸、酒石酸、琥珀酸等都可以通过微生物发酵或转化生产。

超鲜味精

工业化大量生产的核苷酸主要是肌苷酸和鸟苷酸,主要用作调味品。它们的鲜度是味精(?)的数十倍,在味精中添加肌苷酸和鸟苷酸就可制成超鲜味精。

肌苷酸和鸟苷酸可以采用从酵母中提取核酸再加以水解和转化的方法制造,也可以通过枯草杆菌发酵的方法生产肌苷和鸟苷,然后再用化学的方法在肌苷和鸟苷上分别接上一个磷酸,生成肌苷酸和鸟苷酸。

肌苷酸和鸟苷酸的主要生产国是日本,产量在 2500t 左右,产值约为 3 . 5 亿美元。

我国的肌苷酸生产规模比较大,主要用于医药。

维生素

生理学家圣捷尔吉成功地分离提取了维生素 C 而获得了 1928 年度的诺贝尔奖。紧接着,一位荷兰医生因在发现维生素 B1 用于脚气病治疗的重要贡献而获得了 1929 年的诺贝尔奖。

维生素( vitamin )的命名则是由生化学家丰克于 1911 年提出并沿用至今。

维生素是一类人体本身不能合成,但对人体的生长和健康十分必要的有机化合物的总称,包括脂溶性维生素 A 、维生素 D 、维生素 E 、维生素 K 及水溶性维生素 C 和维生素 B1 、维生素 B2 、维生素 B6、维生素 B12 等。由于维生素必须从食物中摄取,在天然食品中含量很少,分布又不均匀,常会引起各种维生素缺乏症。在科学技术已经十分发达的今天,除了从食品中摄取维生素外,还可以服用各种生素制剂以补充维生素不足,这些维生素中很多是采用微生物发酵方法制造的。利用微生物发酵生产的维生素或维生素的前体主要有维生素 B12、维生素 B2以及维生素 A 的前体β-胡萝卜素。维生素 C 则是微生物发酵和化学合成结合的产物。

维生素 B12 又称钴胺素,能促进红细胞的发育和成熟,是治疗恶性贫血的药物,还有促进儿童发育、增进食欲、增强体力、增进记忆力与平衡感等作用。

它还是重要的饲料添加剂。

维生素 B12 主要来源于动物性食品和微生物,一般不存在于植物性食品中。维生素 B12 虽然也可以用化学合成的方法生产,但难度较大。    现在工业上主要是利用谢氏丙酸杆菌、脱氮假单胞菌等微生物的发酵过程生产。维生素 B12 价格比较昂贵,虽然国际市场上年销量只有 3t 左右,销售额却超过 7000 万美元。

维生素 B2 又名核黄素,缺乏维生素 B2 会导致一系列的皮肤和表皮疾病,如口角炎、口腔溃疡、皮炎、较裂、舌头红肿等,这时候就需要服用维生素 B2  工业上主要利用阿氏假囊酵母等酵母菌发酵生产,全世界的产量在 2000 t 以上。

酶制剂

很多工业酶制剂都是利用微生物发酵生产的,其中产量最大的是水解酶类。

例如,利用枯草杆菌能生产淀粉酶和碱性蛋白酶,利用黑曲霉等霉菌可以生产糖化酶,利用绿色木霉可以生产纤维素酶,其他如果胶酶、壳聚糖酶、乳糖酶等都可以通过微生物发酵获得。

水解酶都是胞外酶,表达水平较高,分离提取也较容易,因此生产成本低廉。目前已经广泛用于食品、纺织、洗涤剂等工业部门。

抗生素

最著名的微生物次级代谢物就是抗生素,儿乎所有的人在一生中都或多或少地用过抗生素,它们已经成了人类与细菌感染引起的疾病作斗争的有力武器。

除青霉素(?)外,大部分常见的抗生素都是利用放线菌生产的。它们共同的特点是能抑制某些微生物的生长甚至杀死这些微生物。

已经发现的由微生物产生的天然抗生素已经有 8000 种左右。而将这些抗生素经过一定的化学改造制成的半合成抗生素更是达数万种之多。

当然其中大部分天然抗生素和半合成抗生素并没有应用到医疗上。目前已经商业化生产的抗生素还不到 200 种。 

20 世纪末,世界抗生素市场的年产值大约在 280 亿美元左右。

其中头孢和半合成头孢类抗生素的产值最大,达到 120 亿美元左右。

青霉素类的抗生素产值也较大,达到 44 亿美元左右。

其他产值较大的还有红霉素类(约 35 亿美元)、四环素类(约 14 亿美元)等.

多糖

多糖是由许多单糖按一定的规律聚合而成的大分子物质。常见的淀粉、纤维素、半纤维素、壳聚糖等都是多糖。除了这几种自然界最常见的多糖外,利用微生物发酵还能生产出许多具有特殊功能的多糖。

微生物发酵生产的多糖主要有黄原胶( xanthan )、右旋糖苷( doxtran )、结冷胶( gellan )、小核菌葡聚糖( scleroglucan )、短梗霉多糖( pollulan )和热凝多糖( curdlan )等。它们的应对领域非常广阔。

其中,黄原胶主要用于食品工业和原油开采,年产量达到 3 万吨,年产值约 4 亿美元。

4.微生物在资源开发和能源领域中

目前,微生物在资源开发、转化和能源生产等诸多领域的成功实践正引起各国政府和科技界的高度重视。

微生物冶金

微生物冶金是利用微生物的催化作用将矿物中的金属氧化,以离子的形式溶解到浸出液中加以回收的过程。

由于冶金过程是在水溶液中进行的,因而属于湿法冶金,又称为微生物湿法冶金。

微生物冶金既可以应用于铜、镍、锌等硫化矿的提取,也可用于金、铀等其他金属的提取。

微生物浸取铜

铜矿石的微生物浸出工艺已经有三十多年的历史。

用细菌堆浸法提取铜是微生物在冶金工业中应用最成功的例子。

目前,己有美国  、智利、澳大利亚、加拿大、墨西哥、西班牙、巴西、秘鲁、保加利亚、俄罗斯、南斯拉夫、印度、日本等多个国家都曾进行细菌堆浸回收低品位矿石和地下难采矿石中铜的生产。

其中以美国在这方面所作的工作最多。

微生物浸取金

据统计,国内外金矿中约有 15 %的黄金被包裹在硫化矿物(如砷黄铁矿、硫铁矿、白铁矿以及黄铜矿等)中。这类金矿石或金精矿必须先行氧化,使金粒裸露,才能用氧化物溶液将金溶解,人们常称这类金矿为难处理金矿,是目前黄金工业一大难题。

近年来,用细菌氧化法处理这类金矿发展迅速,南非有 3 个工厂,其中金科( Gencon )公司的 Falrview 金矿是世界上第一个细菌氧化提金厂,从 1986 年投产以来,效益越来越好,金矿的浸出率稳定在 95 %以上。

加拿大有一个厂处理含金、银的尾矿,氧化处理时间 40h 浸出率达 74 %。

微生物浸取铀

加拿大用细菌浸铀的规模最大,历史最久。

加拿大安大略州伊利埃特( EIJLIOT )湖区三铀矿(斯坦洛克、里奥、阿尔干及典尼逊)公司从 20 世纪 60 年代起就开始进行细菌浸铀的实验室研究和现场实验,并很快进行工业生产,年产 U308 60t , 1986 年增至 360t

近年来,法国也有一些铀矿用细菌进行地下浸出,如埃卡尔耶尔铀矿原以化学浸出为主,后改用细菌浸出,到 1975 年产铀量由原 25t 增至 35t

葡萄牙早在 1953 年就曾进行细菌浸铀的实验,在 1959 就有一铀矿采用此法进行生产,铀浸出率达 60 - 80 %。

其他金属微生物采矿除了现在成功用于铜、金和铀之外,对银、锌、锑、锡、镍、钴、锰、钼、钪等金属的开采也有潜在的应用价值,很多工作正在进行中。

微生物与石油开采

石油似乎天生就与微生物有缘。

石油从它的来源和形成到勘探、开采、应用乃至石油在开采、运输和应用过程中造成的污染的清除,到处都有微生物的参与。

而在原油中发现的一些特殊微生物的存在至少可以说明微生物参与了石油的后期演变。

燃料乙醇

 1993 年起,中国已由石油输出国变为石油净进口国, 2002 年中国进口石油已达 7000 万吨,占总需求量的 30 %  2005年石油进口约超过 1 亿吨。

能源缺口日益加大,能源的短缺和能源的安全问题早已为国家重视。

在九届人大四次会议通过的  国民经济和社会发展的第十个五年计划纲要  中把粮食阶段性过剩、开发酒精等石油替代品、节约石油消耗等提到明确的战略高度,中国在乙醇汽油产业的发展方面具有相当的迫切性。

变性燃料乙醇

变性燃料乙醇是以玉米、小麦、薯类、甘蔗、甜菜等为原料,通过专用设备,特定工艺生产的高纯度无水酒精,经过变性处理后,不能食用,仅供混配汽油。

车用乙醇汽油是指在汽油组分油中,按体积比加入一定比例(一般 10 % )的变性燃料乙醇混配形成的一种车用燃料,它是汽油车发动机专用的一种新型的环保燃料。

中国推行乙醇汽油清洁燃料,可以综合解决国家石油短缺、粮食相对过剩及环境恶化三大热点问题,这也将对中国的农业、能源、环保、交通、财政诸方面起到积极的推动作用。

沼气发酵

沼气是作物秸秆、青杂草、人畜粪便等有机物质在适当的温度、湿度、酸碱度和密闭条件下,经过沼气池微生物发酵分解作用产生的一种可燃性气体。

沼气是一种混合气体,主要成分是甲烷( CH4)和二氧化碳( CO2 )。 CH4  60 - 70 % , CO 2 30 - 40 % ,还有少量氢、一氧化碳、硫化氢、氧和氮等气体。由于含有可燃气体甲烷,故沼气可作燃料。

建一口沼气池,需养殖 3 - 5 头猪,每年平均产气 300 -400m3 左右,可满足 3 - 4 口之家常年生活用能。

发展沼气的意义:

1 .实现了无害化农业生产,农产品达到了高产、优质高效。

2 .实现畜禽粪便的无害化处理,促进养殖业持续发展。

3 .改善生态环境,促进农业可持续发展

由于使用沼肥,减少了化肥、农药的施用量,改善了土壤理化性状,提高了土壤肥力,减轻了农业污染,促进了农业生态环境改善,增强了农业发展后劲,保证了农业可持续发展。

 

5.微生物与疫苗

所谓疫苗( vaccine )就是“能够避免瘟疫的物质”。

即一类由病原微生物制成的、经过物理化学方法使其失去致病能力但能诱导肌体产生抗这种病原微生物感染的免疫力的物质。它包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等。

疫苗的种类

国内常将用细胞制成的用作人工主动免疫的生物制品称为菌苗,而将用病毒、立克次体制成的称为疫苗。

而国际上把细菌性疫苗、病毒性疫苗以及类毒素疫苗统称为疫苗。

1 .灭活疫苗

灭活疫苗( inactivated vaccine )亦称死疫苗,是选用免疫原性强的病原体,经人工大量培养后,用物理化学方法灭活制成。

常用的灭活疫苗有:伤寒灭活疫苗、霍乱灭活疫苗、百日咳灭活疫苗和乙脑脊髓灰质炎灭活疫苗。

2 .减毒活疫苗

减毒活疫苗( live - attenuated vaccine )是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。

常用的活疫苗有卡介苗活疫苗、麻疹活疫苗、鼠疫活疫苗和脊髓灰质炎减毒活疫苗。

3 .新型疫苗

新型疫苗( new vaccine )是利用现代生物技术免疫学、生物化学、分子生物学等研制出的新疫苗,主要有下述几种:基因工程疫苗、亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、遗传重组疫苗和自身免疫疫苗等。

基因工程疫苗20 世纪 70 年代之后,随着现代生物技术的迅猛发展,人们开始利用基因工程技术生产疫苗。

基因工程疫苗是将病原体的抗原克隆在细菌或真核细胞内,以利用细菌或真核细胞所生产的病原体的抗原,所以,基因工程疫苗在生产和使用上是安全的。

4.类病毒

类病毒( toxoid )是用细菌的外毒素经 0 . 3 -0 . 4 %甲醛处理制成。虽然其已失去外毒素的毒性,但保留免疫原性,接种后能产生抗毒素。

常用的有白喉类毒素、破伤风类毒素等。

类毒素还常与灭活疫苗混合使用,如百白破三联疫苗。

疫苗技术面临的挑战

在世界范围内,疫苗被应用于预防疾病,为人类健康水平的提高起到了关键作用;许多成功的事实,极大地增强了人类战胜疾病的勇气和信心。

但是传染病问题依然非常严重,自 1981 年发现了人类免疫缺陷病毒( human immunodeficiency virus , HIV ) ,依当时的经验和科学技术水平,认为很快会研制出针对艾滋病的有效疫苗,然而,二十多年过去了,全球艾滋病感染者已达 4000万。

科学技术人员为防治该病已耗资数千亿美元研制 HIV 疫苗,虽有许多实验性疫苗进人临床,但仍然没有真正有效的疫苗问世。

1989 年发现的丙型肝炎病毒,至今使人一筹莫展,它具有类型较多和抗原易变及不能通过组织培养进行人工繁殖,以及相互拮抗的抗原表位复杂的特点,不仅使得传统的疫苗研制方法无法着手,而且运用基因工程的技术也显得无能为力。

2003 年初我国局部地区发生的传染性非典型肺炎,即严重急性呼吸综合症( Severea - Cute respiratory syndrome , SARS ) ,在短短的几个月之内,迅速蔓延到全球三十多个国家和地区,造成全球 8000 人感染,死亡 800 多人。

新的病毒会不断产生( HIV  HCV  SARS 等),而老的病毒又不断变异(流感病毒等)……

 

6.微生物与农用抗生素

农用抗生素指用于农业上防治作物病虫害的抗生素。

按农用抗生素的作用对象来分,可分为杀真菌剂、杀细菌剂、杀病毒剂、杀虫剂、除草剂等。 (1059, 乐果, 杀虫霜……疾病? 自杀……)

昆虫中存在着多种病原病毒,是昆虫致病和死亡的重要病原体。

据有关文献报道,全世界已经从 11 00多种昆虫中发现了 1600 多种昆虫病毒,其中 60 %是杆状病毒。

早在 20 世纪 70 年代初,联合国粮农组织( FAO )和世界卫生组织 ( WHO )就推荐杆状病毒用于农作物害虫的防治。

病毒杀虫剂优点病毒杀虫剂具有许多优点:  对寄主昆虫有高度的毒性和致病性,害虫极少或不产生抗性;  能形成保护性的包含体,对环境因子稳定、不易失活;  寄主范围仅限于无脊椎动物,不至于破坏生态平衡,有利于环境保护,对人、畜和植物无毒,无药害;  在自然条件下容易引起害虫群体病毒病流行。

微生物除草剂

微生物除草剂是利用微生物或其代谢产物防除杂草的制剂。

虽然近年来对真菌除草剂的研究和开发比较活跃,但是到目前为止,已成功生产和大量使用的还仅限于我国的“鲁保一号”和美国的“ Devine ,  Collego 等少数几种。

“鲁保一号”是一种真菌除草剂,其菌种是属于半知菌亚门黑盘孢目毛盘孢菌属的炭疽菌,能使菟丝子感染炭疽病死亡。

 

7.微生物与酶工程

天然酶

自然进化中 天然酶的结构功能对应于其活细胞的生理功能而进化的

天然酶往往不适用于生物技术应用

生物催化剂应用依赖于对天然酶改造或重新设计

 

8.微生物与人类基因组计划

人类基因组计划(HGP

人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出、于1990年正式启动的。

美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序,发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置,破译人类全部遗传信息 

从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。

人类染色体

人类基因组计划完成了人类全部 24 条染色体的 3 X 109 bp 核苷酸序列分析,最终将提供约 4xl04个基因用于人类基因转移和治疗。

在基因鉴定方面,重要基因特别是致病基因的鉴定工作进展较快,高血压、糖尿病、哮喘、精神疾患等多基因疾病相关基因的分离和鉴定工作也正加紧进行,乳腺癌相关基因和肥胖相关基因的克隆和鉴定已经获得一定的成功。

在人类基因组计划中研究的微生物所有的疾病,都可以说是基因病.

单基因病:

"定位克隆"和"定位候选克隆"的全新思路,导致了遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现,为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。

多基因疾病:

心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病(老年性痴呆、精神分裂症)、自身免疫性疾病,是目前疾病基因研究的重点。

随着 HGP 的完成,建立相关方法进行基因功能分析的后基因组学的研究也正在进行,将使人类全方位的理解基因的功能,为基因治疗开辟新的思路。

HGP带来的负面作用

种族选择性灭绝性生物武器

基因专利战

基因资源的掠夺战

基因与个人隐私

人类单倍体基因组

JeffreysDNA指纹

 

9.微生物与克隆技术

克隆,是Clone的译音,意为无性繁殖,克隆技术即无性繁殖技术。

在微生物实验室里 我们通过倒平皿可以在培养基上得到一个个的菌落,  这些菌落其实就是细菌的克隆。

人类的同卵双胞胎就是一对天然的克隆体。 

克隆技术已经历了三个发展时期:第一个时期是微生物克隆,即由一个细菌复制出成千上  万个和它一模一样的细菌而变成一个细菌群。第二个时期是生物技术克隆,如DNA克隆。

第三个时期就是动物克隆,即由一个细胞克隆成一个动物。19972月英国罗斯林研究所宣布克隆成功的小羊多利,是用乳腺上皮细胞作为供体细胞进行细胞核移植的,它翻开了生物克隆史上崭新的一页,突破了利用胚胎细胞进行核移植的传统方式,使克隆技术有了长足的进展。

克隆过程:

克隆羊

克隆猫

本土克隆牛“科科”出生

克隆牛-

总之,微生物生物技术对社会、经济发展的作用与影响是多方面的:

改善农业生产,解决“吃、穿、用”:

提高作物产量,改善作物品质 

发展畜牧业生产

提高人类生命质量,延长寿命

药物开发生产

疾病诊断、预防

…………

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

第九章 微生物活性物质的结构与功能

1.粒毛盘菌多糖纯化、结构与生物活性

1.1国内外真菌多糖研究现状

粒毛盘菌属(Lachnum sp)属于柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae),是分布于世界各地的一类腐生性真菌。长期以来,国内外学者对粒毛盘菌物种多样性进行了大量的研究工作,国内关于粒毛盘菌的研究报道大多来自于庄文颖院士。近几年来,我们研究发现一些粒毛盘菌菌株在深层发酵条件下产生大量多糖等活性物质,具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等活性。

1.2粒毛盘菌YM281胞外多糖的提取纯化及结构解析

YM281胞外多糖的发酵、提取纯化:

种子液:活化后的菌种摇瓶培养4天,摇床转速180r/min、温度25℃。

发酵罐发酵:采用5L自控发酵罐进行液态深层发酵。

发酵液经浓缩、醇沉、H2O2保温脱色、Seveg法脱蛋白、透析、冻干即得粒毛盘菌YM281胞外多糖(LEP)。

1.3粒毛盘菌YM261胞外多糖的抗衰老活性

1.4粒毛盘菌YM278胞外多糖的降血糖活性

1.5粒毛盘菌YM281胞外多糖的降脂利肝活性

1.6粒毛盘菌YM120胞外多糖的预防胃溃疡活性

1.7粒毛盘菌YM120胞外多糖的磷酸化修饰及抗肿瘤活性

 

2. 粒毛盘菌黑色素的结构、氨基酸修饰及生物活性研究

2.1黑色素研究概况

动物:乌骨鸡、头发、果蝇及金乌贼墨汁等

植物:黑芝麻、香蕉皮及乌饭树叶等

微生物:粒毛盘菌属(Lachnum)、暗盘菌属(Plectania)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弧菌属(Vibrio)及假单胞杆菌属(Pseudomonus)等

2.2黑色素功能及应用

食品、农业、材料、化妆品、医药

2.3粒毛盘菌及其黑色素研究概况

粒毛盘菌属(Lachnum sp.)是广泛分布于世界各地的一类腐生性真菌。近年来,研究发现粒毛盘菌在深层培养条件下可以产生黑色素、多糖及多酚等活性物质。

巴西粒毛盘菌黑色素、粒毛盘菌YM-223黑色素 及辛格粒毛盘菌黑色素均不溶于水,性质稳定,具有较强的抗氧化活性。

2.4粒毛盘菌YM-346生长及产胞外黑色素条件优化

单因素实验:从不同培养基、起始pH值、氨基酸及金属离子方面优化粒毛盘菌YM-

346的生长及产黑色素条件。

中心组合实验选择起始pH值、酪氨酸浓度及Mg2+浓度按表2-1进行Central composite试验, 结果见表2-1,利用Design-expert 7.0对试验数据进行分析处理结果如表2-2所示。

2.5粒毛盘菌YM-346胞内黑色素的提取

单因素实验:从NaOH溶液浓度、超声时间、超声温度和超声功率方面优化超声辅助碱提酸沉法提取胞内黑色素的得率。

2.6粒毛盘菌YM-346胞外黑色素的结构及抑菌

胞外黑色素:显微电镜扫描(SEM)元素分析、紫外可见光谱(UV-vis)红外光谱(IR)质谱(MS)、核磁共振氢谱(1HNMR)、热解气质联用(Py-GC-MS)

LEM346的抑菌作用及MIC:LEM346可不同程度的抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌和李斯特菌的生长,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最高(MIC为80 μg·mL?1)

2.7LEM346的精氨酸修饰及其抗氧化活性

2.8粒毛盘菌YM404胞外黑色素的提取、分级分离及其结构解析

2.9 LEM404-a的抗紫外辐射活性及其染色效果

2.10 展望

1.与标品(乌贼黑色素)比较,利用高效液相色谱法测定黑色素的纯度

2.探索同一株粒毛盘菌菌株产生的胞内、外黑色素的体外活性及结构有何异同点

3.水溶性精氨酸-黑色素为混合物(含未修饰的黑色素),进一步考察温度等外界影响因素,使黑色素完全被修饰成为均一的精氨酸-黑色素

4.对黑色素进行毒理性实验(急性及慢性实验),再探索其体内生物活性(免疫调节、急性肝保护、抗病毒等)

 

 

 

第十章 微生物学研究进展及其应用

教师给每个研究生一个关键词或一个题目,每人查阅文献写1篇文献综述,课堂上演讲或汇报;每届内容各不相同。


版权所有:
合肥工业大学食品与生物工程学院
皖ICP备05018251号-1

联系地址:
安徽省合肥市屯溪路193号